一種檢測cyp3a4*1g和mdr1c1236t的基因多態性的hrm方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術和醫學領域，涉及與藥物動力學相關的基因檢測。尤其涉及 一種檢測CYP3A4*1G和MDR1C1236T的基因多態性的HRM方法。利用本發明的方法，一次 可完成大量樣本的快速檢測，方法簡便，準確可靠省時省力，為臨床個體化合理用藥提供方 便。
【背景技術】
[0002] 高分辨率熔解曲線分析技術（HighResolutionMelting)，簡稱HRM，是由美國猶 他大學和愛德華科技公司合作開發的一種SNP以及突變研究的工具，能檢測人類84%的 SNP(單核苷酸多態性）。HRM基于核酸分子物理性質的不同影響解鏈溫度，通過實時檢測升 溫過程中飽和熒光染料與PCR擴增產物的結合情況，從熒光強度和時間曲線上判斷是否存 在SNP。核苷酸雙鏈的熱穩定性受堿基組成、長度和GC含量的影響，序列改變會引起升溫過 程DNA解鏈行為的改變。SNP位點若不匹配會使雙鏈DNA在升溫過程中解鏈，熒光染料從局 部解鏈的DNA分子上釋放，儀器獲得的熒光信號將會減弱。不同SNP位點、雜合子與純合子 等都會影響熔解曲線的峰型，進而有效區分不同基因型。應用HRM曲線對樣品進行分析，極 高的溫度均一性和溫度分辨率使分辨精度達到單個堿基差異的區分。單個堿基引起的解鏈 溫度差異可能不到1°C，HRM具有很高的溫度分辨率，可以每步升溫0. 02~0. 1°C，每升高 一攝氏度采集熒光25次，可滿足單堿基差異的區分。HRM基于高效穩健的PCR技術，不受突 變堿基位點與類型局限，無需序列特異性探針，在PCR結束后直接運行HRM即可完成對樣品 突變、SNP、甲基化等的分析。
[0003] HRM技術應用于基因突變檢測依據于飽和熒光染料，根據熒光信號強度的微妙變 化來判斷基因類別，有著很高的靈敏度和準確度。相對于非飽和染料，飽和染料具有更強的 DNA結合作用和較小的PCR抑制作用，使得DNA在解鏈過程中不會發生重排，熔解曲線有更 高的分辨率。近年來在HRM中應用較多的飽和染料有LCGreen、LCGreenPlus、EvaGreen 和SYT0-9。
[0004] 基因指導下的個體化用藥越來越受到重視，20%~95%的藥物反應和處置的個體 差異是由遺傳因素引起的。基因多態性的存在可能導致治療中不同患者的療效和不良反應 的差異，許多科學家認為編碼藥物代謝酶、藥物轉運體和藥物作用。
[0005] 靶點的基因序列的不同是引起同一種藥物相似劑量在不同個體間產生不同反應 的主要原因。FDA和歐洲EMEA分別于2005年和2010年頒布或起草了關于新藥臨床試驗中 提供藥物基因組學數據的指導文件。
[0006] CYP3A4是CYP3A家族中一個高表達的亞族酶系，CYP3A4*1G在亞洲人的 變異頻率較高。CYP3A4*1G位于CYP3A4內含子10,造成82266位置G到A的取代 (20230G>A，rs2242480)，有研究報道CYP3A4*1G的表達對CNI類免疫抑制劑如環孢素和他 克莫司的藥動學有影響。
[0007] P-gp是MDR1編碼的ATP依賴的跨膜受體，通過在腸道的外排泵活性阻礙環境 毒素和藥物等外源物質的吸收，保護敏感組織及作用底物的排泄，因此會造成藥物處置 和相互作用上的差異，進而影響到藥物的療效和不良反應。目前已研究了 95個MDR1位 點，其中有74個位點具有多態性，研究較多的位點有MDR1C1236T、G2677T/A、C3435T等。 C1236T(rsll28503)位點位于第12個外顯子，其變異屬于不引起氨基酸變化的同義突變。
[0008] SNP的主要檢測方法有以凝膠電泳為基礎的傳統經典法和近些年來發展起來的高 通量、自動化程度較高的測序法，如限制性片段長度多態性法（RFLP)、單鏈構象多態性法、 變性梯度凝膠電泳、等位基因特異性PCR、DNA直接測序法、DNA芯片檢測、飛行質譜儀檢測、 變性高效液相色譜法等。目前普遍應用的基因突變檢測方法有RFLP法和DNA直接測序法。 RFLP法將PCR與限制性酶切相結合，因其實驗操作繁瑣、檢測周期較長、第一輪酶切不完全 導致假陽性結果以及只能用于已知SNP的判斷，無酶切位點的不能檢測等因素，只適合少 量樣本的檢測。變性梯度電泳法有商品化的電泳裝置，適合大樣本檢測篩選，但因為該法是 利用溫度和梯度凝膠遷移率來進行檢測的，需要進行凝膠電泳，DNA鏈二級結構容易造成人 工假相，導致結果出現偏差。DNA直接測序法中PCR產物在全自動測序儀上電泳后進行測 序，方法先進，但是工作量大，耗時較長，價格昂貴，不適合大樣本的檢測。
[0009] 從臨床檢測效率、準確性以及病患經濟條件出發，理想的SNP分析方法應該具備 簡單快速、靈敏準確、經濟實用的特點，近些年發展起來的HRM可以滿足。HRM分析技術以快 速的操作方法獲得需要的基因信息，滿足臨床個體化用藥的時效性和經濟性要求，為臨床 合理用藥提供幫助。
【發明內容】
[0010] 本發明主要目的在于提供一種檢測與藥物動力學相關的基因的檢測方法，尤其涉 及一種檢測CYP3A4*1G和MDR1C1236T基因多態性的簡便快速方法。本發明涉及的HRM曲線 法靈敏度高、特異性好、方法簡單且能實現高通量篩選，操作不需要進行酶切、純化等步驟， 避免人工接觸有毒有害試劑和紫外照射等，安全性較好，并且能實現閉管操作，降低樣本污 染，分析不需要探針，僅在PCR反應體系中增加微量飽和熒光染料，成本較低。
[0011] 具體的，本發明提供了一種檢測CYP3A4*1G和MDR1C1236T基因多態性的方法，所 述的方法是在高分辨率熔解曲線分析技術基礎上，針對目的基因的檢測位點，篩選特異性 引物對和檢測反應條件，完成目的基因的檢測；
[0012] 所述的目的基因的檢測位點是CYP3A4*1G和MDR1C1236T。
[0013] 所述方法包含以下步驟：
[0014] (1)查找目的基因的DNA序列；
[0015] (2)針對目的基因的突變位點設計篩選特異性引物對；
[0016] (3)提取樣本DNA，利用步驟（2)篩選的特異性引物進行基因擴增；
[0017] (4)瓊脂糖凝膠電泳法分析PCR產物是否為特異性擴增；
[0018] (5)根據高分辨率溶解曲線法對擴增后的目的基因的突變位點進行檢測，選用 DNA飽和染料，參照對照樣本HRM曲線完成對樣本基因型的判斷。
[0019] 優選的，所述引物對含有目的基因靶序列中18-27個連續的核苷酸構成的連續核 苷酸序列。
[0020] 優選的，所述方法在PCR反應體系中進行，所述PCR反應體系包括引物、DNA聚合 酶、dNTPs、Mgcl2、模板DNA、PCR緩沖液和熒光染料。
[0021] 在本發明的一個優選實施例中，選用的TaKaRaPremixTaq試劑盒包含Taq?HS、 PCR緩沖液（含Mg2+)、dNTPs。
[0022] 所述PCR反應體系終濃度組成為：
[0023]
[0024] 所述dNTPs混合液包括 0· 4mMdATP、0. 4mMdTTP、0. 4mMdGTP、0. 4mMdCTP的混合 液。
[0025] 優選的，所述的20μLPCR反應體系各組分體積：
[0026]
[0027] 優選的，所述熒光染料為DNA飽和染料SYT0-9。
[0028] 優選的，所述PCR擴增程序中進行PCR擴增反應的條件為95°C預變性10min，95°C 變性30s，50-65°C退火30s，72°C延伸30s，72°C繼續延伸5min，40個循環。
[0029] 優選的，所述瓊脂糖凝膠電泳法分析PCR產物是否為特異性擴增，梯度PCR選擇目 的基因擴增產物退火溫度分別為，CYP3A4*1G:57°C，MDR1C1236T:60°C。
[0030] 優選的，所述HRM曲線法對擴增后的目的基因的突變位點進行檢測。所述進行突 變位點檢測的產物熔解程序中進行產物熔解檢測的條件為95°C變性2min，40°C復性2min; 然后初始熔解溫度60-65°C開始程序升溫熔解至95°C，并在熔解過程中實時檢測熒光信 號，25-45次每秒；然后40°C進行冷卻10s。熔解曲線溫度設定范圍分別：CYP3A4*1G為79~ 88°C，MDR1C1236T為 80 ~88°C。
[0031] 優選的，所述方法具體按照如下步驟進行：
[0032] 1)查找目的基因CYP3A4*1G和MDR1C1236T的DNA序列；
[0033] 2)針對目的基因的突變位點設計篩選合適的引物對；
[0034] 3)提取樣本DNA，利用步驟⑵篩選的引物進行基因擴增；
[0035] 4)瓊脂糖凝膠電泳法分析PCR產物是否為特異性擴增；
[0036] 5)根據高分辨率溶解曲線法對擴增后的目的基因的突變位點進行檢測，選用 SYT0-9飽和熒光染料，參照對照樣本HRM曲線完成對樣本基因型的判斷。
[0037] 優選的，所述模板DNA從健康人全血樣本中提取。<