一種提高土曲霉發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸產(chǎn)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種提高土曲霉發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸產(chǎn)量的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 衣康酸是一種五碳二元羧酸，含有一個(gè)亞甲基，這個(gè)不飽和鍵賦予衣康酸行使聚 合反應(yīng)的功能，因此衣康酸被廣泛應(yīng)用于樹脂和合成纖維的生產(chǎn)，此外，衣康酸作為生物活 性成分可以應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)，作為酶法轉(zhuǎn)化的初始化合物用于合成多功能的平臺(tái)化 合物。
[0003]目前衣康酸的生產(chǎn)主要依賴于利用土曲霉進(jìn)行深層有氧發(fā)酵。土曲霉產(chǎn)衣康酸的 代謝途徑為葡萄糖通過糖酵解途徑和TCA循環(huán)合成檸檬酸，并進(jìn)而合成順烏頭酸，順烏頭 酸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)在烏頭酸脫羧酶的催化下合成衣康酸。糖酵解途徑和TCA循環(huán)的調(diào)控嚴(yán)謹(jǐn)， 而烏頭酸脫羧酶的活性在衣康酸發(fā)酵中保持很高的水平，表達(dá)單一的蛋白難以達(dá)到增強(qiáng)代 謝途徑的目的，但有文獻(xiàn)報(bào)道表達(dá)解除反饋抑制的截短的pfkA蛋白，可以提高衣康酸產(chǎn) 量。
[0004] 衣康酸發(fā)酵需要很高的溶氧，隨著溶氧的增加，衣康酸產(chǎn)量增加。這和黑曲霉產(chǎn)檸 檬酸需要高溶氧相似。在黑曲霉中由于糖酵解途徑的加強(qiáng)，合成過量的NADH，如果通過氧化 磷酸化途徑使NADH通過產(chǎn)生ATP來形成NAD+，會(huì)造成ATP的過剩。土曲霉合成衣康酸的途 徑與黑曲霉產(chǎn)檸檬酸相比，僅增加了 2步反應(yīng)，且都是不需要能量的反應(yīng)，因此，衣康酸發(fā) 酵同樣面臨NAD+庫(kù)的補(bǔ)充和ATP形成解偶聯(lián)的問題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種利用酸誘導(dǎo)的啟動(dòng)子在產(chǎn)酸階段啟動(dòng)Α0Χ 表達(dá)，進(jìn)而提高土曲霉衣康酸產(chǎn)量的方法。由于黑曲霉通過側(cè)呼吸鏈蛋白Α0Χ來行使NADH 到NAD+的轉(zhuǎn)變，不產(chǎn)生能量，借鑒這一原理，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)Α0Χ在土曲霉中的表達(dá)，以實(shí)現(xiàn)NAD+ 庫(kù)的補(bǔ)充。然而，在菌體生長(zhǎng)需要ATP供能的階段需要Α0Χ蛋白表達(dá)沉默，因此本發(fā)明進(jìn)一 步利用酸誘導(dǎo)的啟動(dòng)子Pgas，使Α0Χ僅在產(chǎn)酸階段表達(dá)。
[0006] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是一種提高土曲霉發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸產(chǎn)量的方法，所述方法是 將黑曲霉的Α0Χ基因整合到土曲霉基因組上得到重組土曲霉菌株，利用重組菌發(fā)酵生產(chǎn)衣 康酸；所述Α0Χ基因的表達(dá)受酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的調(diào)控，在酸性條件下誘導(dǎo)表達(dá)。
[0007] 所述Α0Χ基因是a)或者b):
[0008] a)編碼的氨基酸序列如SEQIDN0. 2所示的序列；
[0009] b)具有使NADH在與ATP產(chǎn)生解偶聯(lián)的條件下生成NAD+的功能，其編碼的氨基酸 序列是在a)的基礎(chǔ)上發(fā)生1個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入而得到的。
[0010] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述Α0Χ基因的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0011] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述土曲霉菌株是AspergillusterreusHAT418， 或者購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心的編號(hào)為CICC2433、CICC40205或CICC40832的土曲霉菌株。
[0012] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是Pgas，其核苷酸序列是SEQ IDN0. 3所不的序列。
[0013] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵是在35°C、250r/min下發(fā)酵96h。
[0014] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵使用的發(fā)酵培養(yǎng)基，每L含有：180g葡萄 糖，0·lgKH2P04,3g NH4N03,lgMgS04·7H20,5gCaCl2 ·2Η20,0· 00167gFeCl3 ·6Η20,0· 008g ZnS04·7H20和0· 015g CuS04·7H20 ;培養(yǎng)基pH 3. 1。
[0015] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種重組土曲霉菌株。
[0016] 所述重組土曲霉菌株基因組上含有Α0Χ基因，且Α0Χ基因的表達(dá)受到酸誘導(dǎo)型啟 動(dòng)子Pgas的調(diào)控；所述Α0Χ基因在酸性條件下誘導(dǎo)表達(dá)。
[0017] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述Pgas啟動(dòng)子的核苷酸序列是SEQIDN0. 3所示 的序列；所述Α0Χ基因編碼的的氨基酸序列是SEQIDN0.2所示的序列。
[0018] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述重組土曲霉菌株還整合表達(dá)了潮霉素抗性基 因，以便轉(zhuǎn)化子的篩選。
[0019] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種所述重組土曲霉菌株的構(gòu)建方法，包括：
[0020] (1)構(gòu)建Α0Χ蛋白表達(dá)框Pgas-AOX-trp，所述Α0Χ蛋白表達(dá)框包含Pgas啟動(dòng)子、 Α0Χ蛋白編碼基因和trp終止子；構(gòu)建抗性基因表達(dá)框gpdA-hph-trp，包含元件gpdA啟動(dòng) 子、hph基因和trp終止子，便于陽性克隆子的篩選；
[0021] (2)將Α0Χ蛋白表達(dá)框和抗性基因表達(dá)框一起轉(zhuǎn)化到土曲霉中，得到2個(gè)表達(dá)框同 時(shí)整合到土曲霉基因組中的重組土曲霉。
[0022] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述構(gòu)建方法中，步驟（1)具體是：將trp終止子序 列通過PstI和Hindill酶切，連接到pUC19上，得到pUC-trp載體；將Pgas啟動(dòng)子序列 通過EcoRI和ΚρηI酶切，連接到pUC-trp載體上，得到pUC-Pgas-trp載體；再將Α0Χ序列 用ΚρηI和PstI雙酶切，片段連接到pUC-Pgas-trp載體上，得到pUC-Pgas-AOX-trp表達(dá) 框；抗性基因表達(dá)框以PAN7-1為模板克隆得到。
[0023] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述構(gòu)建方法中，步驟（2)具體是：將Α0Χ蛋白表 達(dá)框和抗性基因表達(dá)框經(jīng)PEG介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入土曲霉原生質(zhì)體中，在潮霉素抗性的高滲軟瓊脂 PDA平板上培養(yǎng)得到陽性克隆，再將經(jīng)培養(yǎng)4-7天的陽性克隆轉(zhuǎn)移至含lg/L潮霉素的平板 上進(jìn)一步培養(yǎng)得到陽性克隆，驗(yàn)證正確的即為重組土曲霉。
[0024] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述trp終止子的序列如SEQIDN0. 6所示。
[0025] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述gpdA啟動(dòng)子的序列如SEQIDN0. 4所不。
[0026] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述hph的序列如SEQIDNO. 5所示。
[0027] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種Α0Χ蛋白表達(dá)框，所述Α0Χ蛋白表達(dá)框包含Pgas 啟動(dòng)子、Α0Χ蛋白編碼基因和trp終止子，按照Pgas-AOX-trp的順序排布。
[0028] 本發(fā)明還要求保護(hù)含有所述Α0Χ蛋白表達(dá)框的菌株以及所述Α0Χ蛋白表達(dá)框在提 高衣康酸產(chǎn)量方面的應(yīng)用。
[0029] 本發(fā)明的有益效果：
[0030] 本發(fā)明利用酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子啟動(dòng)Α0Χ蛋白在土曲霉中表達(dá)，通過增強(qiáng)胞內(nèi)NAD+庫(kù) 的供給，增強(qiáng)糖酵解途徑，從而提高衣康酸的產(chǎn)量。本發(fā)明方法對(duì)產(chǎn)衣康酸的土曲霉菌株具 有普遍適用性，可使土曲霉發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸產(chǎn)量提高近20%，利用Aspergillusterreus HAT418作為宿主，衣康酸產(chǎn)量提高了 20%、產(chǎn)量達(dá)到60g/L以上。
【附圖說明】
[0031] 圖1所示為土曲霉中衣康酸的產(chǎn)量；為Α0Χ轉(zhuǎn)化子的衣康酸產(chǎn)量，□為野生型的 衣康酸產(chǎn)量，▲為Α0Χ轉(zhuǎn)化子的葡萄糖濃度，Λ為野生型的葡萄糖濃度。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 實(shí)施例1 :黑曲霉RNA的提取
[0033] 將黑曲霉孢子接種到檸檬酸發(fā)酵培