淡紫灰鏈霉菌發酵生產α-葡萄糖苷酶抑制劑的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物發酵領域，特別涉及淡紫灰鏈霉菌發酵生產α-葡萄糖苷酶抑 制劑的方法。
【背景技術】
[0002] 糖尿病是以持續高血糖為主要生化特征的綜合代謝性疾病，臨床上主要分為I型 糖尿病和II型糖尿病，我國以II型居多。臨床癥狀表現為血液及尿液中葡萄糖濃度異常 升高，患者有明顯的多飲，多食，多尿，體重減輕的"三多一少"癥狀，并伴隨有疲乏無力的癥 狀。治療II型糖尿病的藥物主要有胰島素及類似物、促胰島素分泌劑、胰島素增敏劑以及 α-葡萄糖苷酶抑制劑。其中，α-葡萄糖苷酶抑制劑已被第三次亞太地區糖尿病治療藥物 指南推薦為降低餐后血糖的一線藥物。II型糖尿病患者服用α-葡萄糖苷酶抑制劑后，抑 制了小腸絨毛上皮細胞刷狀膜上的α-葡萄糖苷酶，可以延緩小腸上段對低聚糖類的分解 和吸收，減少單糖生成，從而使餐后血糖變化平穩，顯著減輕高血糖的危害，減少并發癥和 死亡率。
[0003]目前，已報道的α-葡萄糖苷酶抑制劑種類繁多，但主要都來源于三個方面：天然 產物提取、化學合成產物以及微生物代謝產物。其中天然產物提取大多局限于中草藥，但是 中草藥提取效率較低、成本高，很難產業化。化學合成方法具有目標性強的優點，國外很多 學者嘗試采用化學合成或生物化學合成方法來獲取新的α-葡萄糖苷酶抑制劑。例如，目 前臨床上使用三種α-葡萄糖苷酶抑制劑(阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇）均是通過化 學-生物合成而獲得。阿卡波糖是由？01'11111161'等從游放線菌4 1?6>(/?0/^(30^61〃((3力6 >/76^61的 發酵液中提取出來的，由于這個假性四糖對糖苷酶有很高的親和性，酶活性被抑制，因此降 糖效果良好，于1995年被美國FDA批準上市；伏格列波糖是一種氨基糖類似物，由日本武 田從放線菌代謝產物中分離并通過化學改造得到，它可以競爭性抑制α-葡萄糖苷酶的活 性，從而延緩了腸道對葡萄糖的吸收；米格列醇的結構與葡萄糖相類似，是由Palus等從桿 菌的代謝產物中獲得，并經過化學改造之后于1997年上市，成為一種新型的糖尿病藥物。
[0004] 絕大多數II型糖尿病患者服用上述三種藥物，均可獲得餐后血糖水平降低、糖基 化血紅蛋白降低、空腹血糖及脂肪水平降低，或對胰島素需求降低的效果，但效果與藥物、 劑量、個體因素而存在明顯差異。此外，服藥后，患者會出現如下一些較明顯的不良反應： 胃脹、腹脹、腹瀉、胃腸痙攣性疼痛、頑固性便秘、腸鳴音亢進、排氣增多，部分患者甚至會出 現低血糖和損害肝臟。這些藥物的副作用表明，它們作為α-葡葡糖苷酶抑制劑仍然有待 改進和完善，而患者也需要更安全、更方便的新型藥物。因此，采用微生物發酵法生產新型 α-葡萄糖苷酶抑制劑成為抗糖尿病藥物的研究熱點。
[0005] 檢索到以下關于α-葡萄糖苷酶抑制劑的制備方法及其藥物用途： 中國專利，申請人：趙全成；【申請號】200910067094. 3 ;發明名稱：皂角總苷元及刺囊酸 在制備α-葡萄糖苷酶抑制劑的藥物中的應用；摘要：本發明公開了皂角總苷元及刺囊酸 單一成分在制備α-葡萄糖苷酶抑制劑藥物中的新用途，在制備α-葡萄糖苷酶抑制劑藥 物中可以是皂角總苷元或刺囊酸單一成分，也可以是含皂角總苷元及刺囊酸的組合物；可 用于制備各種藥物制劑。
[0006] 中國專利，申請人：大理學院；【申請號】201010521335.X;發明名稱：B環甲氧基水 飛薊賓用于制備糖苷酶抑制劑的藥物用途；摘要：本發明涉及B環甲氧基水飛薊賓用于制 備糖苷酶抑制劑的藥物用途，具體而言，本發明公開了一種B環甲氧基取代的水飛薊賓酯 型黃酮木脂素或其可藥用鹽用于制備抑制α-葡萄糖苷酶、防治II型糖尿病的藥物之用 途。該黃酮木脂素具有極其顯著的抑制α-葡萄糖苷酶的活性，其40微克/毫升濃度時對 α -葡萄糖苷酶的抑制活性強度已達到75.6%，通過測定其半數抑制濃度顯示：該黃酮木 脂素抑制α-葡萄糖苷酶的強度是陽性對照藥物阿卡波糖的8倍。藥效學結果表明該黃酮 木脂素或其可藥用鹽可預期作為糖苷酶抑制劑藥物尤其是防治II型糖尿病的藥物用途。
[0007] 中國專利，申請人：大理學院；【申請號】201010521360. 8;發明名稱：4-氯肉桂酰 水飛薊賓用于制備糖苷酶抑制劑的藥物用途；摘要：本發明涉及4-氯肉桂酰水飛薊賓用于 制備糖苷酶抑制劑的藥物用途，具體而言，本發明公開了一種4-氯肉桂酰基取代的水飛薊 賓酯型黃酮木脂素或其可藥用鹽在制備抑制α-葡萄糖苷酶、防治II型糖尿病的藥物中 的應用。該黃酮木脂素具有極其顯著的抑制α-葡萄糖苷酶的活性，其在40微克/毫升濃 度時對α-葡萄糖苷酶的抑制活性強度已達到92. 1%，通過測定其半數抑制濃度顯示：該 黃酮木脂素抑制α-葡萄糖苷酶的強度是陽性對照藥物阿卡波糖的30倍。藥效學結果表 明該黃酮木脂素或其可藥用鹽可預期作為糖苷酶抑制劑藥物尤其是防治II型糖尿病的 藥物之用途。
[0008] 中國專利，申請人：大理學院；【申請號】201010521468. 7 ;發明名稱：一種槲皮素二 聚體黃酮用于制備糖苷酶抑制劑的藥物用途；摘要：本發明涉及一種槲皮素二聚體黃酮用 于制備糖苷酶抑制劑的藥物用途，具體而言，本發明公開了一種槲皮素二聚體黃酮或其可 藥用鹽用于制備抑制α-葡萄糖苷酶劑、防治II型糖尿病的藥物之用途，該槲皮素二聚體 黃酮具有極其顯著的抑制α-葡萄糖苷酶的活性，其在4微克/毫升濃度時對α_葡萄糖 苷酶的抑制活性強度已達到75. 0%，通過測定其半數抑制濃度顯示：該槲皮素二聚體黃酮 抑制α-葡萄糖苷酶的強度是陽性對照藥物阿卡波糖的88倍。藥效學結果表明該槲皮素 二聚體黃酮或其可藥用鹽可預期作為糖苷酶抑制劑藥物尤其是防治II型糖尿病的藥物 之用途。
[0009] 中國專利，申請人：大理學院；【申請號】201010521475. 7;發明名稱：Ε環碘取代水 飛薊賓用于制備糖苷酶抑制劑的藥物用途；摘要：本發明涉及E環碘取代水飛薊賓用于制 備糖苷酶抑制劑的藥物用途，具體而言，本發明公開了一種E環碘取代的水飛薊賓酯型黃 酮木脂素或其可藥用鹽用于制備抑制α-葡萄糖苷酶防治II型糖尿病的藥物的用途。該黃 酮木脂素具有極其顯著的抑制α-葡萄糖苷酶的活性，其在4微克/毫升濃度時對α-葡 萄糖苷酶的抑制活性強度已達到64. 1%。通過測定其半數抑制濃度顯示：該黃酮木脂素抑 制α-葡萄糖苷酶的強度是陽性對照藥物阿卡波糖的35倍。藥效學結果表明該黃酮木脂 素或其可藥用鹽可預期作為糖苷酶抑制劑藥物尤其是防治II型糖尿病藥物之用途。
[0010] 以上專利都是天然中草藥提取或利用化學合成技術制備α-葡萄糖苷酶抑制劑， 目前還沒有文獻公開利用淡紫灰鏈霉菌發酵生產α-葡萄糖苷酶抑制劑的方法。
【發明內容】
toon] 本發明的目的是為了提供淡紫灰鏈霉菌發酵生產α-葡萄糖苷酶抑制劑的方法。
[0012] 為了實現上述目的，本發明是通過以下技術方案實現的： 淡紫灰鏈霉菌發酵生產α-葡萄糖苷酶抑制劑的方法，包括如下步驟： (1)菌種活化、保藏 將淡紫灰鏈霉菌（JaKeflWae)UN-8接種于固體斜面培養基上，28~ 35°C恒溫條件下培養3~5天，于2~8°C作短期保存。所述淡紫灰鏈霉菌（ ^3陽/?^<3￡?)1^-8，保藏編號(：〇'(^勵 ：]\1 2015512，保藏日期為2015年9月6日，保藏單位： 中國典型培養物保藏中心，保藏地址：湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學。所述的用蒸餾 水配制固體斜面培養基的濃度組分為：可溶性淀粉10~30g/L，ΚΝ03 0. 2~1.Og/L，NaCl 0· 2 ~1.Og/L，Κ2ΗΡ04 0· 5 ~2.Og/L，MgS04 · 7H20 0· 2 ~1.Og/L，FeS04 · 7H20 0· 005 ~ 0· 02g/L，瓊脂 15 ~20g/L，pH值 7. 0 ~7. 5。
[0013] ⑵種子液制備 一級種子制備：將上述斜面上1. 〇~3. 0cm2的菌苔接入裝有100mL液體種子培養基的 500mL三角瓶中，搖床轉速160~220rpm，28~35°C恒溫條件下培養24~48h;二級種子 制備：將一級種子液接入裝有600mL液體種子培養基的3. 0L三角瓶中，接種量1~5% (v/ v)，搖床轉速160~250rpm，28~35°C恒溫條件下培養24~48h。所述的用蒸餾水配制 液體種子培養基的濃度組分為：可溶性淀粉10~30g/L，ΚΝ03 0 . 2~1. 0g/L，NaCl0. 2~ 1. 0g/L，Κ2ΗΡ04 0· 5 ~2. 0g/L，MgS04 · 7H20 0· 2 ~1. 0g/L，FeS04 · 7H20 0· 005 ~0· 02g/L， pH值 7. 0 ~7. 5。
[0014] (3)液體發酵 將二級種子液按接種量2~10%接入裝有液體發酵培養基的機械攪拌式發酵罐中，發 酵罐容積10~100L，裝液量30~70%，攪拌速度100~600rpm，通氣量0. 5~3.Ovvm，培養 溫度28~35°