一種預測抗pd-l1抗體藥物藥效的檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種預測抗ro-Li抗體藥物藥效的檢測試劑 盒。
【背景技術】
[0002] 治療癌癥傳統的方法是使用特定的物理或者化學手段，直接殺死特定腫瘤的癌細 胞。經過科學家們的努力發現了一種新的治療癌癥的方法，即利用一種藥物松綁免疫系統， 剿滅惡性細胞成為了現實，為癌癥的治療打開了一片新的天地。
[0003]近幾年發現，多種腫瘤細胞表面高表達ro-Ll(也叫⑶274或者B7-H1)，通過與腫 瘤浸潤淋巴細胞表面的ro-ι分子結合，抑制淋巴細胞的功能，是導致腫瘤發生免疫逃逸的 重要原因之一。因此靶向競爭ro-Ll分子，阻斷ro-Ll與ro-i分子的結合，可以阻止腫瘤 細胞的免疫逃逸，從而讓免疫系統重新識別并殺滅腫瘤細胞。
[0004] 目前ro-Ll抑制藥有羅氏公司的MPDL3280A和阿斯利康的MEDI4736,這兩個公司 的藥物在癌癥治療臨床試驗中獲得了很大的進展。其中羅氏公司的MPDL3280A已經結束了 I期臨床研究，這是一項單組、多中心、開放標簽研究，涉及68例經治轉移性膀胱癌患者，其 中30例為H)-L1陽性。經MDPL-3280A治療后隨訪6周，客觀解緩率（0RR)為43% (13/30)， 在隨訪的12周，0RR為52% (13/25)。阿斯利康的MEDI-4736已經在肺癌和頭頸部癌癥治 療中發揮了很好的潛力。雖然這些藥物的療效相比傳統的方法療效好，但是對癌癥病人的 分層并沒有一個好的具有用藥指導意義的分子標記。這對服用這種藥物無效的人群會造成 經濟上不必要的浪費，并且會延誤更好的治療時機。
[0005] 關于預測該類藥物的療效目前科學家們做了大量的研究并發表了大量的文章，目 前有一些假說比如腫瘤細胞表面H)-L1分子的表達、免疫細胞的浸潤、突變負擔、新抗原的 數量、微衛星不穩定性等等指標與該類藥物的療效相關，但是因為缺乏臨床數據或者是檢 查方法花費巨大以及缺乏臨床操作性等等原因，并不能夠很好的實行。
[0006] 具體的現有技術及其缺陷如下：
[0007] (1)全外顯子測序技術預測突變負擔，通過軟件計（NetMHCpantool9(version 2.4))算新抗原的數量。新抗原的數量大，患者的療效好。全外顯子測序技術直接測序法： 該方法的檢測周期較長，成本相對較高。
[0008] (2)檢測MSI(微衛星不穩定）預測腫瘤組織的突變負擔，包括：
[0009]a)免疫組化方法（使用特異性抗體結合腫瘤細胞中MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的 蛋白，結合上才會顯色，如果沒有結合任何的蛋白，則證明發生了MSI);
[0010] b)直接檢測微衛星的重復數量（微衛星位點包括21、NR-24、NR-27、BAT-25、 BAT-26 等）。
[0011] 由于DNA損傷修復涉及的蛋白不僅僅有MMR(錯配修復），DNA復制過程中的P0LD 以及POLE基因也參與了DNA修復，如果僅僅檢測MSI會讓一部分突變負擔重的患者不能被 檢測到。
[0012] (3)通過免疫組化的方法檢測腫瘤組織的ro-Li蛋白的表達。根據視野范圍內，顯 色的細胞的數量比例，來確定結果的分級。（IHC0( < 1% )、1(1% -5% )、2(5% -49% )、 3( > 50% ) 〇
[0013] 通過免疫組化的方法檢測腫瘤組織的ro-Li蛋白的表達。現有的技術不夠客觀， 并且很多的臨床研究數據顯示，腫瘤組織的ro-Li蛋白的表達與ro-Li的療效并不相關，相 關的是腫瘤微環境中的淋巴細胞表面表達的ro-Li。
[0014] 現有的技術都是基于一個假說的前提下，即突變負擔重的腫瘤，會產生大量的新 抗原，因此會吸引大量的具有殺傷性的T細胞，在ro-ι和ro-Li的結合被阻斷了之后，免疫 抑制被松綁，這些本已存在或者因為新抗原吸引的τ細胞就會過來起到殺滅腫瘤細胞的作 用。因此，目前公認的技術都是通過各種指標來預測腫瘤組織中可能產生新抗原的數量程 度。
【發明內容】
[0015] 由于DNA損傷修復涉及的蛋白不僅僅有MMR(錯配修復），DNA復制過程中的P0LD 以及POLE基因也參與了DNA修復，如果僅僅檢測MSI會讓一部分突變負擔重的患者不能被 檢測到。本發明旨在解決該問題，提出一種預測抗ro-Li抗體藥物藥效的檢測試劑盒。
[0016] 為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為：
[0017] 所述預測抗ro-Ll抗體藥物藥效的檢測試劑盒中包括檢測P0LD蛋白和POLE蛋白 外切酶閱讀框結構域對應的基因位點突變的引物及探針。
[0018] 所述P0LD蛋白外切酶閱讀框結構域對應的基因位點位于P0LD1的9-14外顯子， 所述POLE蛋白外切酶閱讀框結構域對應的基因位點位于POLE的6-12外顯子。
[0019] 所述P0LD蛋白外切酶閱讀框結構域對應的基因位點為C284Y、E374K或/和 S478N，所述POLE蛋白外切酶閱讀框結構域對應的基因位點為P286R或/和L424V。這五個 突變位點的關系是并列的，即任何一項的結果是陽性的，該患者的療效對ro-Li抗體藥的 療效會好。
[0020] 優選地，所述引物和探針如下：
[0021] ①檢測P0LD1C284Y、E374K或/和S478N突變的引物和探針：
[0022] C284Y：
[0034]②檢測POLEP286R或/和L424V突變的引物和探針：
[0047] 所述試劑盒中還包括內標，所述內標是含有如SEQIDN0. 21所示序列的 重組載體。優選地，所述內標為PUC18T載體插入如SEQIDN0.21所示序列（5'-CT GGACTTAAATCCTATTGTTCCAGTCCTGTCATCCAGTTAGCTGACTCACGTATTCGTAGCCACCCTTCT GGAGGTGCAATCTAACCTATGTCATCAG-3'）后形成的重組載體，濃度為 1.00E+04copies/ml~ 5. 00E+04copies/ml，作為PCR擴增體系中的陽性內對照，預防由于樣本中可能存在的PCR 干擾物質導致的假陰性；
[0048] 所述試劑盒中還包括如下試劑：
[0049] 核酸釋放劑：濃度為60~100mM/L的氯化鉀，質量百分比濃度為0. 01%~2%的 十二烷基磺酸鈉，體積百分比濃度為0. 05%~1%的乙醇；
[0050]酶混合液：Taq酶 1U/μ1 ~5U/μ1，UNG酶0·5U/μ1 ~2U/μ1 ;
[0051] 陽性對照：為強陽性質粒，其濃度為1. 00~5. 00E+05copies/ml;所述檢測P0LD 蛋白外切酶閱讀框結構域對應的基因位點突變的強陽性質粒序列如SEQIDN0. 19所示， 所述檢測POLE蛋白外切酶閱讀框結構域對應的基因位點突變的強陽性質粒序列如SEQID NO. 20所示；上述質粒是找上海生工人工合成的DNA，連接于T載體，并轉化如大腸桿菌活化 后提取的；
[0052] 陰性對照：為滅菌生理鹽水。
[0053] 試劑盒的PCR反應液：10XPCR反應緩沖液5 μ 1，0. 2mmol/L脫氧核糖核苷三磷 酸，0· 2 μ mol/L~0· 4 μ mol/L的用于革巴多核苷酸擴增的上下游引物（即所述試劑盒中的引 物），0. 2 μ mol/L~0. 4 μ mol/L的用于靶多核苷酸檢測的探針（即所述試劑盒中的探針）， 0· 2 ymol/L~0· 4 ymol/L的用于內標片段擴增的上下游引物，0· 1 ymol/L~0· 2 ymol/L 的用于檢測內標的探針。所述脫氧核糖核苷三磷酸為dATP、dCTP、dUTP、dGTP或dTTP。
[0054] 針對MSI陰性的患者我們在檢測MSI的同時考慮把P0LD以及POLE蛋白閱讀框外 切酶結構域對應的基因位點加進去，從而增加檢測的敏感性。因為MMR和MSI檢測檢驗的是 DNA復制過程中由于DNA聚合酶滑移而引起堿基-堿基錯配和插入-缺失突環的形成，因此 如果檢測結果是MMR或者MSI(微衛星不穩定），主要檢測的是DNA的插入和缺失突變。而 本發明中P0LD以及POLE蛋白閱讀框外切酶結構域關鍵的核苷酸突變會導致DNA合成中產 生的新的突變比如（SNP單核苷酸位點多態）不被糾正，因而產生大量的SNP，從而增加腫瘤 的突變負擔，這種情況MSI是檢測不出來的。本發明通過熒光定量PCR基因突變檢測來預 測抗ro-Li抗體藥物療效，為臨床癌癥患者用藥前療效預測快速檢測開辟新的、簡潔方便 的檢測途徑。熒光定量PCR擴增結束后，通過曲線形狀及Ct值判斷POLE及P0LD1基因突 變，檢測結果可用于用藥前的輔助檢測及療效預測，為臨床診斷和治療提供分子診斷依據。
【具體實施方式】
[0055] 實施例1
[0056] 所述預測抗H)-L1抗體藥物藥效的檢測試劑盒中包括檢測P0LD蛋白和POLE蛋白 外切酶閱讀框結構域對應的基因位點（分別位于P0LD1的9-14外顯子和POLE的6-12外 顯子）的引物及探針。
[0057] 所述引物探針如下：