一種環狀芽孢桿菌的高通量篩選方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于發酵工程和微生物育種的技術領域，涉及一種產β-半乳糖苷酶的環 狀芽孢桿菌的高通量篩選方法。
【背景技術】
[0002] 低聚半乳糖主要是以乳糖為原料通過微生物β-D-半乳糖苷酶催化半乳糖基轉 移反應來生產的，產物主要是三糖（4'或6'-半乳糖基乳糖）和少量的四、五、六糖。低聚半 乳糖的化學式為（半乳糖）η-葡萄糖，η= 2~4。低聚半乳糖結構上連接半乳糖基與半乳 糖基的糖苷鍵類型為β(1 - 3)，β(1 - 4)，β(1 - 6)，其中以β(1 - 4)為主。β-D-半 乳糖苷酶可以催化半乳糖基轉移至葡萄糖的C2、C3、C6位，生成除了β(1 - 1)之外的所有 可能的糖苷鍵類型的半乳糖基轉移二糖。
[0003] 不同菌種代謝產生的β -半乳糖苷酶作用特異性不同，作用于乳糖后生成的低聚 半乳糖含量和結構不同，這種特異性的差異在不同種類的菌中尤為明顯，如環狀芽孢桿菌 或羅倫隱球酵母菌生產的β-半乳糖苷酶催化時，半乳糖單元間的糖苷鍵主要是β(1 - 4) 鍵，而用米曲霉或嗜熱鏈球菌產生的酶催化，糖苷鍵主要是β(1 - 6)鍵。有相關報道證實， 目前已有60多種的低聚半乳糖結構。
[0004] 微生物β -D-半乳糖苷酶易于大量制備、穩定性好。因此，β -D-半乳糖苷酶適合 于生產低聚半乳糖。β-D-半乳糖苷酶來源廣泛，不同種類微生物產生的β-D-半乳糖苷 酶不僅表現在分子量、最適pH值、最適溫度、熱穩定性等酶學性質方面的差異。從自然界直 接分離的菌種，一般而言其酶發酵活力往往是比較低的，不能達到工業生產的要求，因此要 根據菌種的形態、生理上的特點，改良菌種。為了使酶更適合于實際應用，采取不同的方法、 從不同角度對現有菌種和酶進行改造，以期獲得比天然酶更高的活力或不同的催化活性， 提高酶的應用價值。以微生物的出發菌株自然變異為基礎的生產選種的概率并不高，僅為 10 6~10 '為了加大其變異率，采用物理和化學因素促進其誘發突變，以提高菌種產量、性 能的主要手段。誘變育種不僅能提高菌種的生產性能，而且能改進產品的質量、擴大品種和 簡化生產工藝等。從方法上講，它具有方法簡便、工作速度快和效果顯著等優點。因此，在 育種方法上，雖然雜交、轉導以及基因工程、原生質體融合等方面的研究都在快速地發展， 但誘變育種仍為目前比較主要、廣泛使用的育種手段。
[0005]目前相關研究報導證明環狀芽孢桿菌是半乳糖苷酶的重要來源，且所產 半乳糖苷酶對乳糖具有理想的轉化效果。利用環狀芽孢桿菌生產半乳糖苷酶具有 顯著的應用價值。
[0006] 突變菌株的篩選一般多用篩選培養基在搖瓶中發酵培養，該篩選方法存在篩選工 作量大、篩選效率低等問題。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是克服現有技術的缺點與不足，提供一種高產β -半乳糖苷酶的環 狀芽孢桿菌的高通量篩選方法。
[0008] 為達到上述目的，本發明采用以下技術方案：
[0009] -種環狀芽孢桿菌的高通量篩選方法，包括以下步驟：
[0010] (1)出發菌活化：將環狀芽孢桿菌進行劃線培養，挑取單菌落于新鮮的LB培養基 中培養，然后離心收集菌體，重新懸浮于無菌水中；
[0011] (2)紫外誘變：將步驟⑴細胞懸浮液用紫外燈照射；
[0012] (3)氯化理誘變：照射處理后的菌液，立即放入新鮮的LB培養基中，避光培養，并 稀釋菌液濃度，紅光下涂布于含LiCl的LB平板進行培養；
[0013] (4)菌株的篩選：向步驟（3)中誘變獲得的突變株中滴入X-gal溶液，觀察菌落的 顯色情況，篩選菌落變深藍的突變株，接種于含有培養基的96孔板；
[0014] (5)將上述96孔板置于搖床中培養，通過檢測β-半乳糖苷酶活力進行篩選，得到 F1代；
[0015](6)將F1中β-半乳糖苷酶活力最高的菌株重復步驟（2)~（5)，得到高產β-半 乳糖苷酶的環狀芽孢桿菌菌株。
[0016] 進一步地，步驟（1)所述環狀芽孢桿菌的孢子濃度為105~10 8個/mL。
[0017] 進一步地，步驟（3)所述LiCl的含量是0. 05~l.Owt%。
[0018] 進一步地，步驟（4)所述的X-gal溶液的配制方法為：將20mgX-gal用100mL二 甲基甲酰胺進行漩渦混合溶解，再用錫紙包裹避光，置_20°C保存。
[0019] 進一步地，步驟（4)所述96孔板為2mL深孔板，每孔裝液量為500~1200μL。
[0020] 進一步地，步驟（4)所述培養基的組成為：1. 2wt%的大豆蛋白胨、0. 65wt%的酵 母抽提物、〇. 35wt%的磷酸氫二鈉、0. 25wt%的碳酸鈉、0. 55wt%的硫酸鎂、1. 5wt%的乳糖 和95. 50wt%的水。
[0021] 進一步地，該篩選方法包括以下步驟：
[0022] (1)出發菌活化：將環狀芽孢桿菌進行劃線培養，挑取單菌落于新鮮的LB培養基 中，30~40°C培養4~12h后，lOOOOrmp離心lOmin收集菌體，重新懸浮于無菌水中；
[0023] (2)紫外誘變：將步驟⑴細胞懸浮液置于距離30w紫外燈25cm處，照射15~ 30min；
[0024] (3)氯化理誘變：照射處理后的菌液，立即放入新鮮的LB培養基中，避光培養2h， 并稀釋菌液濃度，紅光下涂布于含LiCl的LB平板，30~40°C下培養24h;
[0025] (4)菌株的篩選：向步驟⑶中誘變獲得的突變株中滴入0.02wt%的X-gal溶液， 觀察菌落的顯色情況，篩選菌落變深藍的突變株，接種于含有培養基的96孔板；
[0026](5)將上述96孔板置于搖床中培養，30~40°C、100~300r/min培養36~48h， 通過檢測β-半乳糖苷酶活力進行篩選，得到F1代；
[0027](6)將F1中β-半乳糖苷酶活力最高的菌株重復步驟⑵~（5)，重復2~5次， 得到高產β-半乳糖苷酶的環狀芽孢桿菌菌株。
[0028] 本發明具有以下有益效果：
[0029] 本發明的篩選方法可以提升菌株的篩選量，加快菌種選育進程。該篩選方法利用 傳統物理與化學相結合的誘變方式，提高菌株的突變機率，綜合利用96孔板培養、酶標儀 檢測酶活性的高通量篩選方法，提高篩選效率，提高單位時間內樣本處理量，加快菌種選育 的進程，篩選出最佳生產菌種。采用高通量篩選方法單次可檢測誘變菌株1000株以上，比 常規搖瓶育種（日處理量約40株）的效率提升25倍，為高產β-半乳糖苷酶環狀芽孢桿 菌提供高效、簡單的篩選方法。
[0030] 96孔培養板作為一種高通量篩選工具在細菌優良菌株選育中未見應用，將96孔 培養板應用于細菌突變菌株的篩選，可有效提高篩選效率，減少篩選工作量，本發明用96 孔培養板對誘變后的環狀芽孢桿菌進行高通量篩選，獲得高產β-半乳糖苷酶菌株。
[0031] 用本發明方法篩選所得到的環狀芽孢桿菌菌株的產酶能力達到40~50U/mL，比 出發菌株提高了 45~60%，具備較高的工業應用價值。
【附圖說明】
[0032] 圖1是本發明實施例2的F1代誘變菌株酶活力檢測結果圖；
[0033] 圖2是本發明實施例2的F4代誘變菌株酶活力檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0034] 以下實施例中使用的初始菌環狀芽孢桿菌（Bacilluscirculars)購自美國 菌種保藏中心（ATCC)，編號為31382。但本發明所用的菌株不限于環狀芽孢桿菌ATCC No. 31382,其它環狀芽孢桿菌也適用于本發明。
[0035] 實施例2~5所用發酵培養基的組成為：1. 2wt%的大豆蛋白胨、0. 65wt%的酵母 抽提物、〇· 35wt%的磷酸氫二鈉、0· 25wt%的碳酸鈉、0· 55wt%的硫酸鎂、1. 5wt%的乳糖和 95. 50wt%的水；實施例2~5所用X-gal溶液的配制方法為：將20mgX-gal用100mL二甲 基甲酰胺進行漩渦混合溶解，再用錫紙包裹避光，置_20°C保存。