一種d-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶的異源表達及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程領域，一種優質D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶的異源表達， 酶活性條件優化及其應用。
【背景技術】
[0002] 氨基葡萄糖（GlcN)又稱葡萄糖胺、葡糖胺或氨基葡糖，在體內具有重要的生理意 義：參與肝腎解毒，發揮抗炎、護肝、抗反應性、抗低氧的作用，刺激嬰兒腸道中雙歧桿菌的 增生等；在食品，農業領域及化妝品領域中同樣都有不同程度的應用。GlcN的用途如此廣 泛，而目前國內相關產品較少。
[0003] 甲殼素（chitin)又叫幾丁質，殼多糖廣泛分布于蝦殼，蟹殼，昆蟲等的甲殼中，其 主要組成單位是N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc)，經強酸水解可得到氨基葡萄糖。因此，工業 上通常采用強酸水解的方法生產氨基葡萄糖鹽酸鹽。但是傳統的生產工藝須消耗大量的酸 堿，腐蝕設備，造成環境的污染，且產率低，產物不純，新方法條件要求高。這些在某種程度 上限制了氨基葡萄糖及其衍生物的廣泛應用。利用基因工程技術構建生產氨基葡萄糖的重 組大腸桿菌，然后通過發酵法產氨基葡萄糖是近期發展的另一種方法，目前，發酵法產氨基 葡萄糖的研究集中在霉菌發酵與重組大腸桿菌研究上，但是該方法需要投入大量精力和資 金到基因工程菌的研究上，沒有形成規模化。
[0004] 因此，一種更加溫和，環境友好，產物純度高生產氨基多糖的方法非常迫切。據報 道甲殼素酶可以把甲殼素降解為大量D-乙酰氨基葡萄糖單糖分子，研究證明甲殼素降解 率高達92. 6 % ;然后利用D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶使D-乙酰氨基葡萄糖脫去乙酰基 得到氨基葡萄糖，目前文獻報道中一些脫乙酰基酶可以作用于GlcNAc，但是這些酶的主要 活性不是針對D-乙酰氨基葡萄糖，或者這些酶的活性或產率不高。我們同樣利用已經非常 成熟的基因工程技術，通過基因搜索，克隆，重組表達和生化特性研究等獲得產物單一，且 轉化率達到百分之百的D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶。D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶的 反應式如下：
[0005]
[0006] 但是從甲殼素生成D-乙酰氨基葡萄糖，再生成氨基葡萄糖的仍處于研究階段應 用，需要進一步的實際試驗研究，為實現該方法的規模化生產，是我們今后要努力的方向。
【發明內容】
[0007] 本發明的主要目的在于提供一種優質的D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶，實現 D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶的異源大量表達，相比于化學法生產氨基葡萄糖，酶法生產 將具有極大的工業化潛力。
[0008] 本發明的另一目的在于提供一種D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶的編碼基因。
[0009] 本發明的又一目的在于提供D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶的應用。
[0010] 本發明的目的可以通過以下技術方案實現：
[0011] -種D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶，其氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0012] 上述的D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶的編碼基因，具有下述核苷酸序列之一：
[0013] (1)序列表中的SEQIDN0. 2的核苷酸序列；
[0014] (2)編碼序列表中SEQIDNO. 1氨基酸序列的多核苷酸。
[0015] 含有上述的D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶編碼基因的重組表達載體、轉基因細 胞系和轉基因重組菌。
[0016] 所述的重組表達載體為將權利要求2或3所述的D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶 編碼基因插入到大腸桿菌表達載體中得到的表達D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶的重組表 達載體；所述的大腸桿菌表達載體優選為大腸桿菌質粒pET28a(+)。
[0017] 上述的重組表達載體的制備方法為：采用權利要求2或3所述D-乙酰氨基葡萄 糖脫乙酰基酶編碼基因的核苷酸序列經EcoRI和Xhol雙酶切后與EcoRI和Xhol雙酶切的 pET28a(+)載體連接，得到重組表達載體pET28a(+)_N_acetylglucosaminedeacetylase。
[0018] 所述的轉基因重組菌是將權利要求5或6所述的重組表達載體導入大腸桿菌中， 篩選得到表達D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶的轉基因重組菌；所述的大腸桿菌優選為大 腸桿菌BL21(DE3)。
[0019] 上述的D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶的異源表達，所述D-乙酰氨基葡萄糖脫乙 酰基酶的核苷酸序列編碼，實現在大腸桿菌中異源可溶性表達。
[0020] 上述的D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶的制備方法，培養含有D-乙酰氨基葡萄糖 脫乙酰基酶編碼基因的轉基因細胞系或培養包含D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶編碼基因 的重組表達載體轉化的轉基因重組菌，誘導其表達，收獲表達產物，得到粗酶，通過Ni-NTA 瓊脂糖凝膠親和柱純化得到純酶形式的目的蛋白。
[0021] 上述的D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶在水解D-乙酰氨基葡萄糖使其脫乙酰基制 備氨基葡萄糖中的應用。
[0022] 上述的D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶在水解β-鍵連接D-乙酰氨基葡萄糖的物 質使其脫乙酰基得到β-鍵連接的氨基葡萄糖中的應用。
[0023] 所述β-鍵連接D-乙酰氨基葡萄糖的物質優選為ΡΝΡ-β-GlcNAc和 X-β_GlcNAc〇
[0024] -種制備氨基葡萄糖或β-鍵連接的氨基葡萄糖的方法，是用上述的D-乙酰氨基 葡萄糖脫乙酰基酶水解D-乙酰氨基葡萄糖或β-鍵連接D-乙酰氨基葡萄糖的物質使其脫 乙酰基得到氨基葡萄糖或β-鍵連接的氨基葡萄糖。
[0025] 所述D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶水解D-乙酰氨基葡萄糖或β-鍵連接D-乙酰 氨基葡萄糖的物質的反應條件為：反應溫度為4~60°C，反應pH為7. 0~10. 5,反應底物 的濃度為20~200mM;優選的：反應溫度為42°C，反應pH為9. 0,反應底物濃度為95. 78mM， 此時，反應速率達到最大。
[0026] 本發明涉及從一種海洋圓桿菌（Cyclobacteriummarinum)中克隆的D-乙酰氨基 葡萄糖脫乙酰基酶基因。所述編碼序列如SEQN0. 2所示。本發明還涉及包含所述D-乙 酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶編碼序列的重組表達載體，D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶基因 的核苷酸序列經EcoRI和Xhol雙酶切后與EcoRI和Xhol雙酶切的pET28a(+)載體連接， 得到大腸重組表達載體pET28a(+)_N_acetylglucosaminedeacetylase。本發明還制備 包含本發明D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶編碼基因的轉基因重組菌，將重組好的表達載 體pET28a(+) -N-acetylglucosaminedeacetylase轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)，構成表達 D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶的轉基因重組菌。
[0027] 將轉基因重組菌通過正常的振蕩培養，用IPTG誘導大腸桿菌表達目的蛋白，通過 超聲裂解細胞，收獲表達產物，表達產物利用Ni-NTA瓊脂糖凝膠進行親和純化。對得到的 純化形式的D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶的活性條件進行優化，酶的活性受如底物特異 性，pH，溫度和金屬離子等的影響。本發明中也對D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶的活性進 行這些方面的優化。
[0028] 本發明還對D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶的應用進行簡單涉及，利用核磁共振 技術檢測D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶在沒有任何反應緩沖液和添加物的狀態下的轉化 效率。其轉化結果如圖5所示。
[0029] 本發明的有益效果：
[0030] 本技術方案可以通過生物工程技術得到一種優質的D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基 酶，實現D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶的異源大量表達，底物特異性強，反應效率高，相比 于化學法生產氨基葡萄糖，酶法生產將更具有極大的工業化潛力。
【附圖說明】
[0031] 圖1為海洋圓桿菌（Cyclobacteriummarinum)來源的D-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰 基酶編碼基因在質粒pET28a(+)上的結構圖。
[0032] 圖2為大腸桿