一種鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一株鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株及其應用，屬于獸用生物制品技術領 域。
【背景技術】
[0002] 鴨坦布蘇病毒病（DuckTembusuViralDisease)是由鴨坦布蘇病毒引起的一種 以蛋鴨、種鴨產蛋驟然大幅下降為主要臨床特征、以出血性卵巢炎為主要病變特征的急性 傳染病。其特征是病鴨減料、減蛋，伴有神經癥狀，出現癱瘓、行走不穩，部分病鴨排綠色糞 便；卵巢出血、變形、變性、萎縮、壞死，卵泡破裂等（李玉峰.鴨黃病毒感染研究進展.中國 家禽，2011，33(17) :30-31)。
[0003] 坦布蘇病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，首次于1970年在馬來西亞的庫蚊中分離到， 不過與坦布蘇病毒相關的疫病當時并不清楚。鴨坦布蘇病毒病于2010年4月~6月在我國 首次大范圍爆發，主要集中在種鴨和蛋鴨養殖比較密集的地區。在疫病流行初期，根據卵巢 出血、變性、壞死等特征性病變將其命名為鴨出血性卵巢炎。隨著病原學研究的深入，2011 年中國畜牧獸醫學會第一屆水禽疫病防控研討會將該病名稱統一為"鴨坦布蘇病毒病"（朱 麗萍，顏世敢.鴨坦布蘇病毒研究進展.中國預防獸醫學報，2012, 34(1) :79-82)。
[0004] 鴨坦布蘇病毒可自然感染多種品種的蛋鴨、肉種鴨和野鴨等，感染鴨中以麻鴨多 見，其次是櫻桃谷種鴨，番鴨最少（劉志剛，孫青松.鴨坦布蘇病毒研究進展.中國動物傳 染病學報，2013,21(1) :81-86)。產蛋鴨多以產蛋下降為主要特征，產蛋率一般從70%~ 90%下降至10%以內，甚至完全停產。發病率為100%，由于飼養管理和后期繼發感染的不 同，死亡率約為5%~15%不等。商品鴨、育雛育成鴨可在20日齡前后發病，主要表現神經 癥狀，死亡率為10%~30%不等。本病的病程一般為1~1. 5個月，可自行恢復，但是產蛋 量無法恢復到病前水平。本病的傳播途徑仍然不完全清楚。
[0005] 免疫接種是防治該病的最有效手段。本發明人于2013年3月7日提交了一份申 請號為201310071963. 6的發明專利申請，公開了一種鴨坦布蘇病毒病活疫苗，其疫苗株為 鴨坦布蘇病毒WF100株。實踐中，由于WF100株是一株CEF細胞適應毒株，在￥6仰3!?21等 傳代細胞上增殖的時候出現毒價較低、生產效率較低的問題。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于利用本發明人自行分離、保存的一株鴨坦布蘇病毒強毒株，在 CEF細胞上傳一定代次后轉接Vero細胞，經Vero細胞連續傳代致弱而篩選出增殖水平高、 高度適應Vero細胞、具有良好免疫保護效果的弱毒疫苗株WF120株，該弱毒疫苗株安全性 好，可用于制備鴨坦布蘇病毒病疫苗，有效預防流行鴨坦布蘇病毒的攻擊。經過試驗研究發 現，該毒株E蛋白氨基酸序列與已公開的鴨坦布蘇病毒E蛋白序列相比有特殊的氨基酸位 點差異，并決定了該毒株的安全性及免疫原性，該特征包括：
[0007] 1.DTMUVWF120株E基因與現公開的鴨坦布蘇病毒株比較存在特征性氨基酸位點 排列；
[0008] 2.DTMUVWF120株的E基因與國外坦布蘇病毒參考株MM-1775株相比，核苷酸序列 同源性為90%，編碼的氨基酸序列同源性為96. 6% ;
[0009] 3.WF120株的E基因與國內鴨坦布蘇病毒參考株相比，核苷酸序列同源性為 89. 5%~90. 4%，編碼的氨基酸序列同源性為95. 2~96. 0%。
[0010] 本發明技術方案
[0011] 1. -種鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株，其特征在于該毒株是由鴨坦布蘇病毒強毒株 首先在CEF細胞上傳代，又經過Vero細胞傳代獲得，該毒株被命名為鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusuvirus)WF120株（簡稱DTMUVWF120株，該毒株已于2015年11月16日送交北京 市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中心保藏，保藏號為CGMCCNo. 11591。
[0012] 2.如權利要求1所述的鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株，其特征在于該毒株傳代后的E 蛋白氨基酸序與序列6的同源性為96. 6%以上。
[0013] 3.如權利要求1所述的鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株，其特征在于所述E蛋白氨基酸 序列為序列6。
[0014] 4.如權利要求1所述的鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株的應用，其特征在于該毒株可用 于鴨坦布蘇活疫苗的制備。
[0015] 5.如權利要求4所述的鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株的應用，其特征在于所述鴨坦布 蘇活疫苗的制備過程包括使用CEF細胞或Vero細胞或BHK21細胞作為疫苗抗原制備用細 胞。
【具體實施方式】
[0016] 1.鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株的培育
[0017] 使用9~10日齡活力良好的SPF雞胚制備CEF細胞，待細胞長成單層后，用鴨坦 布蘇病毒（DTMUV)強毒株按照2%~3%接種量接種CEF細胞，傳代以進行適應性增殖。待 感染CEF細胞病變穩定后，對傳代毒進行純化。純化毒繼續傳一定代次后轉接Vero細胞， 經Vero細胞連續傳至120代，進行安全性評價，試驗如下：
[0018] 將P120代毒接種170日齡左右產蛋鴨（產蛋率85%左右），每只肌肉注射lml，并 設置生理鹽水對照組。自接種之日起，每日觀察、記錄接種鴨群的發病情況、采食量和產蛋 量。
[0019] 結果顯示P120代毒接種產蛋鴨后，與對照組比較采食量和產蛋量無明顯下降。剖 檢卵巢無出血、變形等病理變化。說明P120代毒已經致弱，對產蛋鴨沒有致病性。
[0020] 將P120代毒在170~200日齡產蛋鴨上連續傳代5代，每代均觀察、記錄接種鴨 的臨床表現、采食量和產蛋量。結果顯示P120代毒經產蛋鴨傳至第5代，接種鴨的精神狀 態、采食、糞便等仍表現正常，與對照組比較產蛋量無明顯差異。說明P120代毒無毒力返 強。選取P120代毒作為疫苗研制的候選毒株，命名為鴨坦布蘇病毒（DuckTembusuvirus) WF120株（簡稱DTMUVWF120株），該毒株已于2015年11月27日送交北京市朝陽區北辰 西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 保藏，保藏號為CGMCCNo. 11591。
[0021] 2.鴨坦布蘇病毒病活疫苗的制備方法
[0022] 使用DTMUVWF120株作為疫苗生產用毒種，使用微載體懸浮培養Vero細胞、懸浮 培養冊1(21細胞和轉瓶培養CEF細胞作為抗原制備用材料及方法，將DTMUVWF120株接種生 長良好的細胞，連續培養觀察72~96小時，當細胞病變達80%左右時，收獲感染的病毒懸 液，加入耐熱凍干保護劑，經真空冷凍干燥，制成鴨坦布蘇病毒病活疫苗。
[0023] 3.病毒株特性研究
[0024] (1)鴨坦布蘇病毒弱毒疫苗株的增殖
[0025] 1)將經CEF細胞傳代的病毒液接種Vero細胞連續傳代，培養的病毒液病毒含量較 高，可達l(f5TCID5Q/ml;
[0026] 2)將DTMUVWF120株病毒按0. 5~1 %比例接種長成良好單層的Vero細胞，置 37°C、5%C02培養箱中靜置培養，每天觀察CPE，72~96小時后，當細胞病變達80%左右時 收獲，置_70°C保存。病毒含量彡10s'5TCID5Q/ml。
[0027] (2)免疫原性
[0028] 取45只160日齡左右健康易感產蛋鴨，隨機分為3組，15只/組，第1組肌肉注射 DTMUVWF120株病毒液，0. 5ml/只（含104'°TCID5。)，第2、3組肌肉注射等量生理鹽水分別作 為攻毒對照和空白對照。免疫后21天，第1組和第2組用鴨坦布蘇病毒強毒株攻毒，肌肉 注射，1.0ml/只。攻毒后觀察21日，統計各組的產蛋情況，與攻毒前1周的產蛋率比較，免 疫組和空白對照組產蛋無下降，攻毒對照組攻毒后第3周產蛋率下降46%。結果見表1。
[0029] 表1WF120株毒種對產蛋鴨的免疫攻毒試驗結果
[0030]
[0031] ⑶純凈性
[0032] 按現行《中國獸藥典》（中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二〇一〇年版 三部.中國農業出版社，2011)附錄進行，DTMUVWF120株毒種無細菌、霉菌、支原體和外源 病毒污染。
[0033] ⑷特異性
[0034] 將DTMUVWF120株毒種用MEM液稀釋至400TCID5(]/0. 1ml，與等量抗鴨坦布蘇病毒 特異性血清混合后，37°C中和1小時，接種已長成單層的CEF細胞96孔細胞培養板，共接種 12孔，每孔0. 2ml。另設病毒對照和正常細胞對照，各接種6孔，每孔0. 2ml。將細胞培養板 置37°C、含5%C02培養箱中培養，連續觀察120小時。中和組和正常細胞對照組未出現細 胞病變效應（CPE)。病毒對照孔全部出現CPE。
[0035] 4.DTMUVWFG36C株和WF120株的