細胞的回收方法及用于該方法的加工骨的制作方法
【專利說明】
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及使用骨的外表面被包被劑包被的加工骨的細胞的回收方法及該加工骨。
【【背景技術】】
[0002]骨，一般而言，其表面被骨膜覆蓋。骨膜的內側由骨質(致密質及海綿質)構成，在骨質的內側有被稱為髓腔的被骨髓填滿的內腔。在骨髓中存在各種類的細胞，這些細胞被總稱為骨髓細胞。
[0003]骨髓被作為造血器官為人所知，在骨髓細胞中含成熟及未成熟的血液細胞、以及造血干細胞。所以，為免疫學研究或毒性試驗等的目的，進行著從實驗動物的骨采集骨髓。
[0004]在狗及猴等的大動物的情況中，可在麻醉下由骨髓穿刺針從骨直接采集骨髓。另一方面，在大鼠及小鼠等的小動物的情況中，可摘出大腿骨而切除骨的兩端部(骨端)，通過使用帶注射針的注射器從截面向骨內注入胎牛血清(FBS)等的液體，使骨髓流出而采集(參照例如，Kakiuchi S.等人，J.Toxicol.Sc1.，vol.29，N0.2，p.101-111，2004)。
【
【發明內容】
】
[0005]【發明要解決的技術課題】
[0006]本發明人將通過向骨的內部注入液體而回收骨內的細胞的上述方法應用于從大動物摘出的骨。即，本發明人，從豬摘出的大腿骨中，縱向隔開間隔而開2個孔，從一個孔導入生理鹽水，試著從另一孔回收含細胞的液體。結果，令人驚訝地，從孔不太回收得到含細胞的液體，其幾乎全部自骨的表面漏出。如此，本發明人新發現，在由向骨內的液體的導入的細胞的回收方法中，由于液體自骨的表面漏出，無法以高收率回收骨內的細胞。
[0007]【解決課題的技術方案】
[0008]本發明人經銳意研究的結果發現，由向在骨的內部的液體的導入回收骨內的細胞的方法中，通過用包被劑覆蓋骨的外表面，可抑制含細胞的液體從骨的外表面漏出，從而完成本發明。
[0009]本發明提供細胞的回收方法。此方法包括以下的工序。
[0010](1)通過加工自活體采集的骨，制備加工骨的工序、
[0011]其中上述加工骨的上述骨的外表面由緊密附著于骨的外表面的包被劑包被，并且有貫通上述包被劑及上述骨的外表面而到達上述骨的內部的第1及第2孔，
[0012](2)從上述第1孔向加工骨內導入液體的工序、及
[0013](3)從上述第2孔回收含細胞的液體的工序。
[0014]另外，本發明提供上述的方法中使用的加工骨。此加工骨是，
[0015](1)上述加工骨由從活體摘出的骨制備，
[0016](2)上述骨的外表面由上述緊密附著于骨的外表面的包被劑包被，
[0017](3)具有用于向骨內導入液體的第1孔和用于回收含細胞的液體的第2孔，
[0018](4)上述第1及第2孔貫通上述包被劑及骨的外表面而到達骨的內部。
[0019]【發明效果】
[0020]由本發明，在由向骨的內部導入液體的回收骨內的細胞的方法中，使抑制含細胞的液體從骨的表面漏出，有效回收細胞成為可能。
【【附圖說明】】
[0021]【圖1】是對本實施方式的細胞的回收方法適宜的灌流系統的模式圖。
[0022]【圖2】是在實施例1中，向用聚二甲基硅氧烷(PDMS)包被的加工骨導入生理鹽水時的照片。
[0023]【圖3】是在比較例1中，向未包被的豬大腿骨導入生理鹽水時的照片。
[0024]【圖4】是在實施例2中，向用PDMS包被的加工骨導入生理鹽水時的照片。
[0025]【圖5】是在比較例2中，向未包被的豬大腿骨導入生理鹽水時的照片。
[0026]【圖6】是在實施例3中，向用環氧油灰包被的加工骨導入生理鹽水時的照片。
[0027]【實施方式】
[0028]以下參照附圖描述本發明的優選的實施方式。
[0029]本實施方式的細胞的回收方法(以下，也簡稱為“方法”)是從上述的加工骨的第1孔導入液體，從第2孔回收含細胞的液體的方法。本實施方式的方法可用手動方法實施，也可由使用送液栗等的灌流系統實施。適宜于本實施方式的方法的灌流系統之一例示于圖1。圖1所示的灌流系統主要由用包被劑102包被的骨101 (加工骨)、灌流液瓶201、送液栗202、回收瓶301、連接它們的管401?407、以及三通活塞501及502構成。在圖1中，箭頭示作為灌流液的液體流的方向。
[0030]在圖1所示的灌流系統中，可從導入口 A經管404將任意的成分添加到液體。例如，可將細胞添加到液體而向骨內導入，觀察回收后的該細胞的變化等。從而，在用本實施方式的方法回收的細胞中，不僅骨髓細胞，也含自外部添加的細胞。自回收口 B可采樣回收瓶301中回收的含細胞的液體。以下，對本實施方式的方法的各工序進行說明。
[0031]在本實施方式的方法中，首先進行制備骨的外表面由緊密附著于骨的外表面的包被劑包被，并且有貫通包被劑及骨的外表面而到達骨的內部的第1及第2孔的加工骨的工序。
[0032]制備成加工骨的骨也可為魚類、兩棲類、蟲類、鳥類及哺乳類之任何的動物的骨，在它們之中，特別優選除人之外的哺乳類的骨。作為那樣的哺乳類的動物，優選為用于動物實驗的動物或家畜，例如，可舉出豬、牛、馬、山羊、綿羊、猴、狗、貓、兔、豬鼠、大鼠、小鼠等。
[0033]骨的種類不特別限定，如果是硬骨，則也可使用長骨、短骨、扁平骨及不規則骨的任何的種類的骨。作為長骨，例如，可舉出上腕骨、橈骨、尺骨、中手骨、大腿骨、脛骨、腓骨、中足骨等。作為短骨，例如，可舉出手根骨、足根骨等。作為扁平骨，例如，可舉出頭頂骨、胸骨、肋骨、腸骨等。作為不規則骨，例如，可舉出椎骨、肩甲骨等。
[0034]在本實施方式的方法中，制備成加工骨的骨優選使用剛從動物摘出之后的骨。骨的摘出后不立即實施本實施方式的方法時，也可冷藏摘出的骨。冷藏溫度可為一般溫度、例如可為4°C。摘出后立即冷藏保存時，優選在摘出后1天以內使用。從動物摘出骨的方法本身是現有技術中公知的。
[0035]加工骨的制備工序包括將骨用包被劑包被的工序，及向骨開第1及第2孔的工序。在本實施方式中，進行包被骨的工序和向骨開第1及第2孔的工序的順序不特別限定。例如，也可將骨用包被劑包被之后，貫通該包被劑及骨的外表面而向骨開到達骨的內部的孔。或者，也可在骨上開到達內部的孔之后，不堵塞該孔而用包被劑包被該骨。首先在骨上開孔時，將該骨用包被劑包被之前，例如，可通過將與孔有相同的直徑的管或棒、優選注射針插入各孔，確保孔不被包被劑堵塞。
[0036]加工骨的第1及第2孔是貫通包被劑及骨的外表面而到達骨的內部的孔。在本實施方式中，骨上的孔的位置不特別限定。例如，向長骨的骨干等被骨膜覆蓋的部分開孔時，第1及第2孔成為貫通包被劑及作為骨的外表面的骨膜而到達骨的內部的孔。另一方面，在骨的關節面無骨膜，關節面被關節軟骨覆蓋。從而，向骨的關節面開孔時，第1及第2孔成貫通包被劑及作為骨的外表面的關節軟骨而到達骨的內部的孔。再有，向骨開孔的手段不特別限定，使用針或鉆等的工具即可。
[0037]在本實施方式中，第1孔的深度優選為自此孔導入的后述的液體與骨髓接觸成為可能的深度。另外，第2孔的深度優選為從此孔回收后述的含細胞的液體成為可能的深度。作為那樣的第1及第2孔的深度，例如，是達骨質的深度，優選為達海綿質的深度，更優選為達髓腔的深度。
[0038]第1及第2孔的大小只要是液體的導入及含細胞的液體的回收是可能的大小就不特別限定。例如，第1及第2孔的直徑是，為了液體的導入及含細胞的液體的回收而是與使用的管或注射針相同的直徑即可，可將直徑在0.3mm以上2.1mm以下的范圍內適宜設定。
[0039]在本實施方式的方法中，由于向骨的內部導入液體而回收細胞，在第1孔和第2孔之間優選有一定的距離。第1孔和第2孔之間的距離根據骨的大小適宜決定即可。例如，在大腿骨等的長骨的情況中，可在接近一側骨端的骨干部分開第1孔，在接近反對側的骨端的骨干部分開第2孔。
[0040]在本實施方式中，第1及第2孔可為各自各1個，也可為多個。第1及第2孔的數可互相相同，也可不同。
[0041]在本發明中，包被劑通過緊密附著于骨的外表面，為了抑制要從第2孔回收的液體及細胞自骨的外表面漏出而使用。從而，包被劑只要是共具可緊密附著于骨的外表面、且可抑制從骨的外表面的液體及細胞的漏出的2個性質的物質、材料或制品，就不特別限定。作為那樣的包被劑，例示有現有技術中公知的樹脂、粘接劑、高分子膜、凝膠、石膏等。在本發明中，從這些包被劑之中可使用1種或2種以上。
[0042]在本實施方式中，骨內的細胞與后述的液體一同回收，所以包被劑優選有不透過水的性質。另外，骨干燥，則骨內的細胞有損傷的可能性，所以包被劑優選在骨的外表面濕的狀態下也可緊密附著于骨。
[0043]在本實施方式中，只要包被劑和骨的外表面無隙間相接，則包被劑和緊密附著于骨的外表面的原理或形態等不特別限定。即，包被劑和骨的外表面可僅簡單密接，也可機械結合，也可物理或化學地相互作用。作為機械結合，可舉出通過包被劑流入骨的外表面的微小的凹部而固化的錨定效果。作為物理的相互作用，可舉出由范德華力的結合及靜電相互作用等。作為化學相互作用，可舉出形成共價鍵或離子鍵的化學相互作用等。另外，在骨的外表面部