干的顆粒狀細胞培養基的制作方法
【專利說明】干的顆粒狀細胞培養基
[0001] 本申請是申請日為2011年11月18日、發明名稱為"的顆粒狀細胞培養基"的中 國專利申請201180060097.X(國際申請號PCT/EP2011/005830)的分案申請。
[0002] 本發明涉及不包含蛋白胨或胰蛋白胨的干的顆粒狀細胞培養基，尤其涉及支持哺 乳動物和/或昆蟲和/或植物細胞生長的干的顆粒狀細胞培養基制劑。本發明還涉及這些 干的顆粒狀細胞培養基的生產及其用途。
[0003] 發明背景
[0004] 細胞培養基在人工環境中支持并維持細胞的生長。
[0005] 取決于生長將受到支持的生物的類型，細胞培養基可以包含10種以上，有時100 種以上的不同組分。
[0006] 哺乳動物、昆蟲或植物細胞的增殖所需的培養基通常比足以支持細菌和酵母生長 的基本培養基更復雜。
[0007] 細胞培養的早期研究使用由未確定成分的組分，例如血漿、血清、胚胎提取物、其 他未確定成分的生物提取物或蛋白胨組成的培養基。因此，在化學上確定成分培養基的發 展成為了主要的進步。在化學上確定成分的培養基通常包含但不是排他地限于氨基酸、維 生素、金屬離子、抗氧化劑、螯合劑、生長因子、緩沖劑、激素、氯化物和本領域技術人員已知 的許多其他物質。
[0008] 將一些細胞培養基提供為無菌的水成液。液體細胞培養基的缺點是其貨架期縮 短，并且運輸和貯藏困難。因此，現在許多細胞培養基都提供為細磨干粉混合物。生產所述 細磨干粉混合物的目的是通常將其與其他補充物一起在水和/或水溶液中以所設計的溶 解狀態溶解，以給生物細胞提供用于生長和/或從相同的所述細胞中產生生物藥物的基本 營養基礎。
[0009] 細磨粉末的處理具有明顯的缺點。例如，處理它們時粉塵很大，量大時更是如此， 特別是在一些個別原料對健康有害的情況下，這可以導致處理該物質的工人的健康問題。 即使個別組分并非是直接有毒的，但通過可呼吸的空氣本身中高的粉塵水平也可以引起工 人的健康問題，并且由于該問題，在許多國家中都嚴格規定了空氣中的粉塵量。此外，如果 量過多，并且沒有采取足夠的警戒措施防止火花點燃，那么有機物質的粉塵，更特別地細粉 塵可以容易地導致爆炸。
[0010] 此外，在不利的運輸條件下，例如在長期運輸條件期間，干粉培養基的一種或多種 較輕的各個組分朝表面移動或者一種或多種較重的組分朝原包裝的底部移動。這種局部較 高濃度或者在疏松材料的物理中心，某些個體組分消耗的結果會以許多方式負面地影響培 養基的產品質量。此外，分層對每批次的靶生物藥物分子的產生量或者更精細地對生物藥 物自身的寡糖模式的影響遠遠超過物理消耗和各個組分的濃度，使得培養基質量對直到患 者使用之前生物藥物的質量絕對是關鍵的。
[0011]另一方面是當使用細磨干粉培養基時，難以在水溶液中溶解細粉末，來制備最終 的含水的細胞培養基。潤濕細磨粉末并將其溶解在水成液中是非常困難的。因此，粉末培 養基的處理及其應用是相當復雜的。
[0012] 由于干粉培養基在穩定性、混合和溶解方面的局限，所以通常以干燥形式生產的 培養基不具有一些關鍵的補充物，例如碳酸鹽、水解產物、生長因子和其他微量元素，當最 終用戶將干粉培養基制備成液體時，他們將補充這些補充物。額外的處理和補充將增加發 生昂貴錯誤以及勞動力的可能性。
[0013] 已知通過將粉末擠壓成小顆粒可以使粉末狀細菌細胞培養基粒化。該結果是小顆 粒在安全性、處理和性能方面更有優勢。對于細菌細胞培養基可以容易地實現該步驟，因為 它們包含在化學上成分不完全確定的蛋白胨或胰蛋白胨或者等同的肽組分，其支持通過自 身固有粘性粘附培養基組分。
[0014] 哺乳動物和/或昆蟲和/或植物細胞培養基通常不含有蛋白胨或其等同物，因此 更難以該方式處理。
[0015] Invitrogen Corporation的US 6, 383, 810 B2公開了產生團集的真核細胞培養基 粉末的方法。該方法包括用溶劑潤濕干粉細胞培養基，然后重新干燥濕潤的培養基，以獲得 干的團集細胞培養基。
[0016] 該方法的最大缺點是整個培養基組分都需要與水接觸，并且然后需要將它們加熱 以除去水的事實。這可能在培養基的組分之間引起相當多的副反應，或者破壞或修飾敏感 性組分，對培養基質量造成不可預測的結果。
[0017] 因此，存在發現哺乳動物和/或昆蟲和/或植物細胞培養基的新形式的明確需求， 所述形式容易處理，并可以在培養基組分之間不引起破壞和/或副反應的情況下生產。
[0018] 發明簡述
[0019] 已經發現，通過壓實干燥培養基組分的混合的細磨粉末，可以以干的顆粒形式產 生無蛋白胨的在化學上確定成分的哺乳動物和/或昆蟲和/或植物細胞培養基。通過在輥 式壓制機中擠壓團聚可以實現壓實。不需要將任何添加劑用于輔助該處理。根據本發明的 干的顆粒狀細胞培養基具有長的貨架期、易于處理并可以在非常溫和的條件下生產，以至 于在生產過程中，所述培養基組分不會由于被潤濕或被加熱而發生副反應。
[0020] 因此，本發明涉及產生并不包含蛋白胨或胰蛋白胨的干的顆粒狀細胞培養基的方 法，其包括
[0021]a)以培養基組分的混合粉末形式提供細胞培養基，其中該混合的粉末不包含蛋白 胨或胰蛋白胨；
[0022] b)在輥式壓制機中壓實所述混合的粉末。
[0023]在優選的實施方案中，在步驟a)中提供的細胞培養基是哺乳動物細胞培養基。
[0024]在優選的實施方案中，在步驟a)中提供的細胞培養基包含一種或多種糖類組分、 一種或多種氨基酸、一種或多種維生素、一種或多種鹽、一種或多種緩沖劑組分、一種或多 種輔因子以及一種或多種核酸組分。
[0025] 在非常優選的實施方案中，步驟b)通過如下步驟實施
[0026] bl)在輥式壓制機中壓實所述混合的粉末；
[0027] b2)將在步驟bl)中獲得的具有小于0. 2_顆粒大小的經壓實的細胞培養基的所 有部分，以待填充到輥式壓制機中的培養基組分的混合粉末形式再引入到細胞培養基中。
[0028]在優選的實施方案中，輥式壓制機的擠壓能力在30至80kN/cm輥寬之間。
[0029]本發明還涉及可以根據本發明的方法制備的不含蛋白胨或胰蛋白胨的干的顆 粒狀細胞培養基。在優選的實施方案中，顆粒狀細胞培養基的80%以上的顆粒具有大于 0· 5mm的大小。
[0030] 在非常優選的實施方案中，顆粒狀細胞培養基的90%以上的顆粒具有大于0. 5mm 的大小。
[0031] 在另一個優選的實施方案中，不含蛋白胨或胰蛋白胨的干的顆粒狀細胞培養基是 在化學上確定成分的哺乳動物細胞培養基。
[0032] 在另一個優選的實施方案中，不含蛋白胨或胰蛋白胨的干的顆粒狀細胞培養基包 含一種或多種糖類組分、一種或多種氨基酸、一種或多種維生素、一種或多種鹽、一種或多 種緩沖劑組分、一種或多種輔因子以及一種或多種核酸組分。
[0033] 本發明還涉及通過以下步驟將不含蛋白胨或胰蛋白胨的干的顆粒狀細胞培養基 用于培養根據本發明的細胞的用途，所述步驟包括：
[0034] a)在溶劑中溶解不含蛋白胨或胰蛋白胨的干的顆粒狀細胞培養基，以形成液體細 胞培養基；
[0035] b)將所述液體細胞培養基與待培養的所述細胞接觸。
[0036] 在優選的實施方案中，待培養的所述細胞是哺乳動物細胞。
[0037] 在優選的實施方案中，步驟a)中的溶劑是水。
[0038] 除上述本發明的單個實施方案和方面外，本發明還實現并實踐了兩個或兩個以上 所公開的實施方案或方面的每一組合。
[0039] 發明詳述
[0040] 圖1顯示適合于本發明的干壓實設備的示意圖。
[0041] 根據本發明的干法制粒在不添加水或其他溶劑的情況下，通過在壓力下壓實粉末 產生顆粒或微粒。通常，根據本發明所使用的輥式壓制機還產生了更大的壓實物或薄片。通 常例如通過振動篩溫和地打碎如此形成的這些壓實物，以產生顆粒狀的微粒（團塊）。根 據本發明，粉末或細磨粉末是顆粒的組合物，其中80%以上的所述顆粒大小（直徑）小于 0.2_。優選地，粉末是干的且自由流動的。表述"自由流動的粉末"指的是其中的顆粒并 不相互粘著的粉末（通過研磨、微制粒或相似的技術制備）。通常，表現出低于約50度靜止 角的全部粉末都顯示出合適的流動性質，但如本文中所用，術語干的且自由流動的還應當 指粉末的肉眼觀（意為粉末看起來是干的且自由流動的）。
[0042] 根據本發明細胞培養基是維持和/或支持細胞體外生長的組分的任意混合物。細 胞培養基可以包含維持和/或支持細胞體外生長所需的全部組分或者僅一些組分，以便分 開地加入其它組分。根據本發明細胞培養基的實例是包含維持和/或支持細胞體外生長所 需的全部組分、培養基補充物或進料的完全培養基。在優選的實施方案中，細胞培養基是完 全培養基。
[0043] 通常，將根據本發明的細胞培養基用于維持和/或支持細胞在生物反應器中的生 長。
[0044] 哺乳動物細胞培養基是維持和/或支持哺乳動物細胞體外生長的組分的混合物。 哺乳動物細胞的實例是人類或動物細胞，優選地CH0細胞、C0S細胞、IVER0細胞、BHK細 胞、AK-1細