高效降解黃曲霉毒素b1和赭曲霉毒素a的溶桿菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物學及生物降解領域，具體地說，涉及一種高效降解黃曲霉毒素 B1和赭曲霉毒素A的溶桿菌及其應用。
【背景技術】
[0002] 曲霉類真菌毒素主要由黃曲霉、寄生曲霉和赭曲霉等曲霉菌產生的次生代謝產 物，已分離鑒定了二十多種結構類似物，其中以黃曲霉毒素B1 (AFB1)和赭曲霉毒素A (0ΤΑ) 毒性最大，在農業生產和食品工業中污染最為廣泛。1993年黃曲霉毒素被世界衛生組織 (WHO)癌癥研究機構劃定為I類致癌物，因其具有強烈的致癌、致畸和致突變性，已逐漸成 為公共健康和科研領域關注的焦點。黃曲霉毒素和赭曲霉毒素污染谷物和油料作物已成為 全球性問題，在畜牧業中，兩類曲霉毒素可通過污染飼料危害動物健康，導致畜牧業生產率 低下，造成嚴重的經濟損失，并通過直接或間接（動物產品傳播）途徑污染食品，影響人類 的身體健康。動物從飼料中攝入AFB1或AFB2,經體內轉化為AFM1或AFM2,存在于奶、肉 和禽蛋中，污染人類食物鏈。2011年底，我國乳制品行業發生的黃曲霉毒素超標事件即為 AFB1污染飼料導致奶制品AFM1超標的典型案例，已引起我國政府和食品安全部門的高度 重視。隨著人們對真菌毒素危害性認識的逐步加深，對于曲霉類真菌毒素檢測、污染防控和 脫毒技術方面的研究工作也在不斷深入，其與人們生活品質、身體健康和經濟利益休戚相 關。
[0003] 近幾年，發現了多種微生物對黃曲霉毒素具有顯著的降解或吸附作用。例如，丁 酸弧菌屬（Butyrivibrio sp·)、乳酸桿菌（Lactobacillus sp·)、鏈球菌（Streptococcus sp·)、雙歧桿菌（Bifidobacterium sp.)和不動桿菌屬（Acinetobacter sp.)等。目前報 道的絕大多數脫毒菌種在實際應用中存在如下兩方面的共性問題：其一，部分脫毒菌種的 脫毒機理屬于物理吸附，并非實質性的生物降解，吸附在菌體細胞壁的毒素，在動物或人體 內不同理化環境下可能發生解吸附作用，沒有實質性脫毒意義；其二，報道菌種對毒素的脫 毒率多數在100μg/kg以上較高濃度條件下測定，對于食品原料和飼料等復雜基質中低濃 度曲霉類毒素（低于20yg/kg)的實際脫毒能力研究鮮見報道。然而，低劑量、復合污染及 高污染率又是曲霉類真菌毒素污染的普遍特征，而且20μg/kg的低濃度曲霉類真菌毒素 已能夠對人畜臟器造成傷害，尤其是被多種毒素復合污染的農產品，其毒性更具有顯著的 增效作用。因此，發掘具有降解低濃度條件下，多種曲霉類真菌毒素復合污染的脫毒菌種， 在農業生產和食品安全領域具有重大的實踐意義和應用價值。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種高效降解黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的溶桿菌及其 應用。
[0005] 為了實現本發明目的，本發明從受多環芳烴嚴重污染的土壤（煉油廠、汽車修理 廠附近）和受真菌毒素嚴重污染的霉爛食品樣品中分離出一株能夠高效降解黃曲霉毒素 B1和赭曲霉毒素A的菌株CW239。在顯微鏡或電鏡下觀察，該菌的主要形態學特征為：革蘭 氏陰性，無芽孢，桿狀至長桿狀，無鞭毛，不運動（圖1A和圖1B)。該菌嚴格好氧，最適生長 溫度為25-30°C，最適生長pH為6. 8-7. 5,在R2A培養基上培養2天后，呈現黃色圓形菌落。
[0006] 基于菌株CW239的形態特征和16SrDNA序列（SEQIDNo. 1)，參考《常見細菌系 統鑒定手冊》，將該菌株鑒定為溶桿菌（Lysobactersp.)。該菌株于2015年6月14日保藏 于中國典型培養物保藏中心（簡稱CCTCC，地址：中國武漢，武漢大學，郵編430072)，保藏編 號為CCTCCNO:M2015372。
[0007] 體外試驗表明，菌株CW239在短時間具有顯著的赭曲霉毒素（OTA)和黃曲霉毒素 B1 (AFB1)的降解效果。在0ΤΑ終濃度為20μg/L的液體培養基中，菌株CW239處理12h， 對OTA的降解率為53. 1 %，48h降解率達到99. 8% ;在AFB1終濃度為20μg/L的液體培養 基中，菌株CW239處理12h，對AFB1的降解率為42. 5 %，48h降解率達到83. 4 %。用菌株 CW239處理毒素污染的飼料（終濃度20μg/kg)，48h對0ΤΑ降解率為68. 7%，AFB1降解率 為 52. 1%〇
[0008] 本發明還提供含有溶桿菌CW239的菌劑及其復合微生物菌劑。
[0009] 本發明還提供由溶桿菌CW239或所述菌劑制備的黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A 雙功能生物降解劑。
[0010] 優選地，所述生物降解劑中活性成分為由所述菌劑制備的粗酶液。
[0011] 更優選地，所述生物降解劑中活性成分為菌株CW239的發酵液、菌株CW239發酵液 經離心所得上清液或菌體裂解液。
[0012] 其中，菌株CW239的發酵培養基為：胰蛋白胨17.0g/L，大豆胨3.0g/L，葡萄糖 2. 5g/L，NaCl5. 0g/L，K2HP042. 5g/L，以水配制。發酵條件為：30°C，180r/min振蕩培養 48h。
[0013] 本發明還提供溶桿菌CW239、所述菌劑和所述生物降解劑在黃曲霉毒素B1和赭曲 霉毒素A生物降解中的應用。
[0014] 本發明還提供溶桿菌CW239、所述菌劑和所述生物降解劑在霉變食品原料或飼料 脫毒處理中的應用。
[0015] 其中，所述霉變食品原料或飼料中黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的含量分別為 20μg/kg及以下，但不局限于20μg/kg及以下濃度。
[0016] 本發明進一步提供溶桿菌CW239或所述菌劑在制備黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素 A雙功能高效生物降解劑中的應用。
[0017] 與現有的黃曲霉毒素降解菌相比，本發明的溶桿菌CW239能夠在低濃度黃曲霉毒 素B1和赭曲霉毒素A污染條件下達到極佳的降解效果。根據國家食品及飼料衛生標準規 定，谷物類農產品黃曲霉毒素含量必須低于20μg/kg，赭曲霉毒素含量不得超過5μg/kg， 飼料中的赭曲霉毒素A也不得超過100μg/kg(GB2761-2011，GB13078. 2-2006)。實際上， 動物毒理實驗表明，連續喂養含有20μg/kg毒素的飼料，就可以對大鼠的內臟器官造成嚴 重的傷害（Weietal.，2014D0I10. 1002/jsfa. 6649)。因此，菌株CW239 對低濃度AFB1 和 0ΤΑ具有高效的降解脫毒能力，在食品/飼料生物脫毒應用方面具有實質性的應用價值和 重大意義。
【附圖說明】
[0018] 圖1A和圖1B為本發明菌株CW239的電子顯微鏡照片。
[0019] 圖2為本發明實施例2和3中菌株CW239對曲霉毒素的動態降解曲線。
[0020] 圖3為本發明實施例2中菌株CW239粗酶液對曲霉毒素的動態降解圖。
【具體實施方式】
[0021] 以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例 中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。
[0022] 實施例1黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A降解菌的篩選、鑒定和培養
[0023] 1、菌株的篩選
[0024] 樣品采集自受多環芳烴嚴重污染的土壤（煉油廠、汽車修理廠附近）和受真菌毒 素嚴重污染的霉爛食品。取采集樣品0. 5g加入150mL富集培養基中（0ΤΑ和AFB1含量各為 20μg/L左右），在30°C恒溫培養箱中富集培養7天。第一次富集培養結束后，取5mL富集培 養液接種到150mL新鮮的0ΤΑ和AFB1富集培養基中，將0ΤΑ和AFB1的濃度提高到30μg/ L，在相同條件下繼續富集培養7天。以相同的富集方法完成第三次富集培養實驗，提高OTA 和AFB1的濃度至50μg/L。富集培養結束后，用無菌水將富集培養液作梯度稀釋，將梯度 稀釋液分別涂布于0ΤΑ或AFB1固體分離培養基，30°C條件下培養3天。培養結束后，挑取 培養皿單菌落接種于含有0ΤΑ和AFB1各20μg/L的富集培養基內進行降解測試培養48h， 同時設置不接菌的陰性對照。降解培養結束后，培養液經二氯甲烷提取，按照國家標準高效 液相色譜熒光檢測法（HPLC-FLD，參照中華人民共和國國家標準GB/T25220-2010和GB/T 18979-2003進行）檢測培養液中兩類毒素殘留濃度，與對照相比計算降解率。最終，分離獲 得一株在低濃度0ΤΑ和AFB1條件下（0ΤΑ和AFB1含量< 20μg/L)仍保持高效降解率的菌 株CW239。
[0025] 其中，富集培養基為：葡萄糖5.Og/L，蛋白胨5.Og/L，酵母粉2. 5g/L，檸檬酸銨 1.Og/L，NaAc· 3H20 2. 5g/L，MnS04 · 4H20 0· 05g/L，Κ2ΗΡ041·Og/L，MgS04 · 7H20 0· 2g/L，吐 溫-800. 5mL，OTA添加濃度 20-50μg/L，AFB1 添加濃度 20-50μg/L，調pH至 6. 2-6. 5。
[0026] 分離培養基為：葡萄糖10. 0g/L，蛋白胨10. 0g/L，酵母粉5. 0g/L，檸檬酸銨2. 0g/ L，MgS04 · 7H20 0· 58g/L，NaAc· 3H20 5. 0g/L，MnS04 · 4H20 0· 28g/L，吐溫-801.OmL,調pH 至 6. 2-6. 5。
[0027] 上述培養基在120°C條件下高壓滅菌15min，使用前添加無菌OTA和AFB1毒素標 準溶液至規定濃度，固體培養基按以上配方加2. 0%的瓊脂粉。
[0028] 2、菌株CW239的鑒定
[0029] 菌株CW239的主要形態學特征為：革蘭氏陰性，無芽孢，桿狀至長桿狀，無鞭毛，不 運動（圖1A和圖1B)。該菌嚴格好氧，最適生長溫度為25-30 °C，最適生長pH為6. 8-7. 5， 在R2A培養基上培養2天后，呈現黃色圓形菌落。
[0030] 16SrDNA鑒定：利用細菌的16SrDNA通用引物 (27F5'