一種獲得具有快速生長能力的分枝桿菌菌種的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種獲得具有快速生長能力的分枝桿菌菌種的方法，屬于菌種選育技 術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 雄烯二酮是從精巢或尿中提取出的具有雄性激素作用的一種留類化合物，單 純的依靠化學(xué)方法生產(chǎn)雄烯二酮遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到市場的需求。通過微生物選擇性降解甾醇 側(cè)鏈，可得到制備留體激素類藥物的重要中間體雄烯二酮（雄留-4-烯-3, 17-二酮， androst-4-ene-3，17-dione，簡稱AD)。因此采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)生產(chǎn)AD具有產(chǎn)品純度 高、生產(chǎn)成本低、周期短等特點(diǎn)，是當(dāng)前的一大趨勢。
[0003] 但目前市場上雄烯二酮仍處于供不應(yīng)求的狀態(tài)，主要原因是雄烯二酮生產(chǎn)廠家 少，市場需求大。本企業(yè)以生產(chǎn)雄烯二酮為主，生產(chǎn)上存在的困難是：菌株轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng)，但 種子生產(chǎn)周期較長，易染菌，增加動力消耗，增加生產(chǎn)成本，嚴(yán)重影響生產(chǎn)效益。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明利用原生質(zhì)體融合技術(shù)，將具有不同特性的菌種進(jìn)行融合，能夠得到具有 兩種生長特性的新菌株，從而縮短種子生長周期，減少動力消耗，降低生產(chǎn)成本；同時(shí)拓寬 了微生物的遺傳種質(zhì)資源，豐富了基因庫的內(nèi)容，促進(jìn)了微生物菌種選育技術(shù)的進(jìn)步。
[0005] -.高轉(zhuǎn)化能力分枝桿菌菌株I的獲得，其步驟是： 通過分離、初篩和復(fù)篩選，取一株能夠?qū)⒅参锪舸几咝мD(zhuǎn)化的分枝桿菌菌株作為初始 菌株I。
[0006] 所用斜面平板篩選培養(yǎng)基為（g/L):葡萄糖20,黃豆餅粉5,檸檬酸3,磷酸二氫 鉀，0.5,尿素0.5,七水硫酸0. 1，硫酸亞鐵0.01，碳酸鈣2,瓊脂20 ;種子瓶培養(yǎng)基為（g/ L):葡萄糖30,黃豆餅粉10,檸檬酸3,硫酸銨，15,磷酸二氫鉀0.5,七水硫酸0. 1，硫酸亞鐵 0.01，碳酸鈣2,玉米漿5,泡敵0.2，pH值8.0。;發(fā)酵瓶培養(yǎng)基為（g/L):硝酸鈉6,磷酸氫二 銨0.5,玉米漿15,豆油160,甾醇35.pH值8.0。
[0007] 二.具有快速生長能力的分枝桿菌菌株II的獲得，其步驟是： 通過分離、初篩和復(fù)篩選，取一株能夠?qū)⒅参锪舸几咝мD(zhuǎn)化的分枝桿菌菌株作為初始 菌株II 所用斜面平板篩選培養(yǎng)基為：BD瓊脂培養(yǎng)基（REF213000)，種子瓶培養(yǎng)基為：葡萄糖5， 硝酸鈉6,磷酸氫二銨0.5,丙三醇1.5,泡敵0. 1 ;pH值8.0 ;發(fā)酵培養(yǎng)基為：硝酸鈉6,磷酸 氫二銨0.5,玉米漿15,豆油160,甾醇35.pH值8.0。
[0008] 三.菌株I和II的原生質(zhì)體融合，其步驟是： (1)孢子懸液的制備：將菌株I和II分別制備成孢子懸液。
[0009] (2 )菌體的培養(yǎng)：取適量孢子懸液接入種子瓶內(nèi)，在適宜條件下將菌體培養(yǎng)至對數(shù) 生長期。
[0010] (3)原生質(zhì)體的融合：將菌株I和II進(jìn)行原生質(zhì)體融合，包括原生質(zhì)體的分離、再 生以及原生質(zhì)體的融合。
[0011] (4)篩選合適菌株：隨機(jī)挑選若干融合后長出的菌株，制備母斜面，培養(yǎng)成熟后接 搖瓶進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測定其效價(jià)。
[0012] (5)遺傳穩(wěn)定性考察：對篩選得到的合適菌株進(jìn)行多次傳代試驗(yàn)，考察其遺傳性狀 的穩(wěn)定性，最終篩選得到轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)且生長速度快的菌株。
[0013] (6)發(fā)酵罐試驗(yàn)：將所篩選的合適菌株進(jìn)行發(fā)酵罐試驗(yàn)，測定其效價(jià)。
[0014] 以上所述的原生質(zhì)體融合過程中溶酶菌濃度為2. 5mg/ml，34°C，酶解lh;熱滅活 溫度為60°C，時(shí)間為lOmin。
[0015] 篩選配方、搖瓶培養(yǎng)和發(fā)酵配方同一。
[0016] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及效果 1.本發(fā)明中利用原生質(zhì)體融合技術(shù)對菌株進(jìn)行篩選，不存在遠(yuǎn)源雜交不融合的缺點(diǎn)， 所篩選出的菌種穩(wěn)定性好，是一種比較理想的微生物菌種定向選育方法。
[0017] 2.利用原生質(zhì)體融合技術(shù)時(shí)遺傳物質(zhì)得到充分重組，獲得轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)且生長速度 快的重組子。有效地提高菌株生長速度，縮短了發(fā)酵時(shí)間，減少了動力消耗，降低了生產(chǎn)成 本。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面通過實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，下述實(shí)例是說明性的，不是限定性的，不 能以下述實(shí)例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0019] 一.選取一株高轉(zhuǎn)化能力的分枝桿菌菌株I 1.分離 從保存的原始菌株甘油管中吸取lml菌懸液，梯度稀釋涂布到原始配方的的平板上， 30 土 1°C，濕度 30%-60% 培養(yǎng) 7 天。
[0020] 2.制備斜面菌種 挑選菌落直徑為4mm以上，形態(tài)邊緣不規(guī)則，橙黃色的單菌落均勻涂布到斜面培養(yǎng)基 上，30 土 1°C，濕度30%-60%培養(yǎng)7天。
[0021] 3.搖瓶考察 將成熟斜面接種到種子瓶中，30土 1°C，濕度30%-60%培養(yǎng)70h，菌體量大，pH值達(dá)到8. 0 以上轉(zhuǎn)接到發(fā)酵瓶中，發(fā)酵瓶30土 1°C，濕度30%-60%培養(yǎng)7天，放瓶測效價(jià)，選取轉(zhuǎn)化能力 最高的DY327作為出發(fā)菌株，能夠?qū)?. 5%留醇轉(zhuǎn)化完全，AD生成量為1. 83g。
[0022] 二.選取一株生長速度快的分枝桿菌菌株II， 1.分離 從保存的原始菌株甘油管中吸取lml菌懸液，梯度稀釋涂布到原始配方的的平板上， 30 土 1°C，濕度 30%-60% 培養(yǎng) 7 天。
[0023] 2.制備斜面菌種 挑選菌落直徑為4mm以上，形態(tài)邊緣不規(guī)則，橙黃色的單菌落均勻涂布到斜面培養(yǎng)基 上，30 土 1°C，濕度30%-60%培養(yǎng)7天。
[0024] 3.搖瓶考察 將成熟斜面接種到種子瓶中，30 土rC，濕度30%-60%培養(yǎng)40h，選取在40h時(shí)菌體量大 且pH值達(dá)到8. 0以上的菌株DY381作為出發(fā)菌株。
[0025] 三.菌株的原生質(zhì)體融合 1. 菌懸液的制備 取菌株I(DY327)和II(DY381)成熟斜面各一支，將菌體刮下，放入裝有無菌水和玻璃 珠的三角瓶中，打散均勻后，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將菌體濃度調(diào)整為10s個/ml，作為待處理菌 液， 2. 菌體培養(yǎng) 在500ml的三角瓶內(nèi)裝100ml種子培養(yǎng)基，接種菌懸液1. 0ml，30°C，200rpm振蕩培養(yǎng) 到對數(shù)生長期。為使生長的菌體容易被溶菌酶酶解成原生質(zhì)體，需加入等體積0. 5%的甘氨 酸高滲預(yù)處理lh。
[0026] 3原生質(zhì)體的融合 A.原生質(zhì)體的分離 3000r/min離心