一種巨大口蘑菌株及其試管菌種與制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種巨大口蘑菌株及其試管菌種與制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 巨大口蘑(R.Heim)Pegler&Lodge]主要分布在云南 的玉溪和普洱的熱帶地區(qū)，通常發(fā)生于6、7月份，是體型巨大，肉質(zhì)肥厚，可食用的大型真 菌，有著很好的經(jīng)濟效益。但是野外產(chǎn)量不極為穩(wěn)定，發(fā)現(xiàn)的時候通常是一大叢簇生在一 起，有時受自然條件因素影響，不會發(fā)生，嚴重影響該菌的商業(yè)化。因此研究該菌的人工馴 化生產(chǎn)栽培技術(shù)，提高產(chǎn)量速進生產(chǎn)發(fā)展是關(guān)鍵。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003] 本發(fā)明第一目的在于提供一種巨大口蘑菌株，第二目的在于提供一種巨大口蘑 M-001#的試管菌種，第三目的在于提供所述巨大口蘑M-001#的試管菌種的制備方法。
[0004] 本發(fā)明第一目的是這樣實現(xiàn)的，所述的巨大口蘑菌株為巨大口蘑M-001#菌株，保 藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏日：2015年8月21 日，保藏編號：CGMCCNo. 11205;所述巨大口蘑M-001#菌株屬于真菌界、擔子菌門、傘菌綱、 傘菌目、口蘑科、巨大口蘑屬。
[0005] 巨大口蘑M-001#菌株的獲得與鑒定 1、將采集的巨大口蘑子實體菌柄和菌蓋交接處組織塊接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上， 于20~28°C下培養(yǎng)7~14d，對分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時剔除已污染的試管，挑選 出無污染、長勢良好且菌核生成能力強的菌株，獲得巨大口蘑分離試管種，所述的試管瓊脂 培養(yǎng)基的配方：土豆16. 12%，葡萄糖1. 61%，瓊脂1. 61%，ΚΗ2Ρ04 0 . 04%，MgS04 0 . 02%，所述的 百分數(shù)是質(zhì)量分數(shù)。
[0006] 2、將巨大口蘑分離試管種菌絲體接種到平板培養(yǎng)皿上進行菌種純化，培養(yǎng)條件為 20~26°C下避光，所述的瓊脂培養(yǎng)基的配方：土豆16. 12%，葡萄糖1. 61%，瓊脂1. 61%，ΚΗ2Ρ04 0. 04%，MgS04 0 . 02% ;所述的百分數(shù)是質(zhì)量分數(shù)；2d后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面上， 所述的培養(yǎng)基配方：土豆16. 12%，葡萄糖1. 61%，瓊脂1. 61%，KH2P04 0 . 04%，MgS04 0 . 02% ;所 述的百分數(shù)是質(zhì)量分數(shù)；于20~26°C下培養(yǎng)7~14d，獲得巨大口蘑純化試管種。
[0007] 3、采用供試子實體與對應(yīng)菌絲分離物，分別按CTAB方法提取巨大口蘑基因組 DNA，進行PCR擴增及ITS序列測定，將所測得試驗樣品的ITS序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST序列比對分析，與NCBI中的巨大口蘑 0? 序列Identities= 580/583 (99%)，Gaps= 1/583 (0%)，分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為本發(fā)明所述的巨大口蘑（I )菌絲體。
[0008] 本發(fā)明的有益效果是：將巨大口蘑的菌種進行人工馴化培養(yǎng)，并篩選出生長迅速， 污染率低的優(yōu)良菌種。為巨大口蘑人工栽培提供了菌種保障，人工栽培的成功也將促進野 生資源保護。
[0009] 本發(fā)明所提供的巨大口蘑M-001#菌株保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心；地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號；保藏日期：2015年08月21日； 保藏登記入冊的編號CGMCCN0. 11205。
[0010] 本發(fā)明第二目的是這樣實現(xiàn)的，是以所述巨大口蘑菌株M-001#經(jīng)斜面培養(yǎng)后制成 的試管菌種。
[0011] 本發(fā)明的第三目的是這樣實現(xiàn)的，是將巨大口蘑菌株M-001#的菌絲體接種到試管 瓊脂培養(yǎng)基斜面上，在溫度為20~28°C下培養(yǎng)7~14d，得試管菌種。
[0012] 本發(fā)明的有益效果是：將巨大口蘑的菌種進行人工馴化培養(yǎng)，并篩選出生長迅速， 污染率低的優(yōu)良菌種。為巨大口蘑人工栽培提供了菌種保障，人工栽培的成功也將促進野 生資源保護。
【具體實施方式】
[0013] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制， 基于本發(fā)明教導所作的任何變換或改進，均落入本發(fā)明的保護范圍。
[0014] 本發(fā)明所述的巨大口蘑菌株為巨大口蘑M-001#菌株，保藏單位：中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏日：2015年8月21日，保藏編號：CGMCC No. 11205;所述巨大口蘑M-001#菌株屬于真菌界、擔子菌門、傘菌綱、傘菌目、口蘑科、巨大 口蘑屬。
[0015] 本發(fā)明所述的巨大口蘑M-001#的試管菌種，是以所述巨大口蘑菌株M-001#經(jīng)斜面 培養(yǎng)后制成的試管菌種。
[0016] 本發(fā)明所述的巨大口蘑M-001#的試管菌種的制備方法，是將巨大口蘑菌株M-001# 的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，在溫度為20~28°C下培養(yǎng)7~14d，得試管菌種。
[0017] 所述的試管瓊脂培養(yǎng)基為改良PDA培養(yǎng)基，其成分為：土豆15~17g，葡萄糖 1. 5~L7g，ΚΗ2Ρ040·02~0· 06g，瓊脂 1. 5~L7g，MgS040·01~0· 03g，其余為水，pH值為 7.0。
[0018] 下面通過實施例加以說明： 下述實施例中使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0019] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0020] 以下實施例野生巨大口蘑在云南省玉溪市易門縣樟木箐采集；采集方法為徒手采 集，采集時候注意保持子實體完整、無霉變、無病蟲害。
[0021] 實施例1 1. 1巨大口蘑M-001#的獲得 ⑴將采集的野生巨大口蘑子實體切成塊即組織塊，將組織塊接種到菌種分離純化培養(yǎng) 基斜面上，于20°C下培養(yǎng)12d，對分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時剔除已污染的試管， 挑選出無污染、長勢良好的菌株，獲得巨大口蘑分離試管種；所述的菌種分離純化培養(yǎng)基的 配方為： ⑵將巨大口蘑分離試管種菌絲塊接種到瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進行菌種純化，培 養(yǎng)條件為20-26Γ避光，所述的瓊脂培養(yǎng)基的配方：土豆16. 12g，葡萄糖1. 61g，瓊脂1. 61g， ΚΗ2Ρ04 0· 04g，MgS04 0· 02g，蒸餾水100ml，pH值7. 0 ;2d后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜 面上，于20°C下培養(yǎng)7d，獲得巨大口蘑純化試管種即為獲得的新的巨大口蘑菌株，所述的 培養(yǎng)基配方法：土豆16. 12g，葡萄糖1. 61g，瓊脂1. 61g，KH2P04 0· 04g，MgS04 0· 02g，蒸餾水 100ml，pH7·Ο〇
[0022] 通過菌絲體產(chǎn)量、抗污染力等性狀比對，挑選出菌絲體產(chǎn)量高、抗污染的巨大口蘑 液體菌種專用菌株Μ-001#。
[0023] 1.2鑒定及其特征、命名、保藏 ⑴子實體特征 M-001#分離用子實體特征為：高25~45cm。菌蓋直徑30~40cm，灰褐色；菌褶白色，較 寬；菌柄長22~41cm，直徑3~5. 5cm，白色，基部稍膨大成杵狀。擔孢子4個，橢圓形，（6~7) MmX(7~9)Mm。
[0024] (2)巨大口蘑M-001#菌株純化試管種特征 接種后，在培養(yǎng)溫度為22°C的條件下，18h就開始萌發(fā)，生長初期菌絲緊貼培養(yǎng)基， 無色，有光澤，一般為較粗的不分支或分支較少的菌絲；第一天長速最快為0. 3cm，最慢為 0.lcm，而后隨菌落的增大，有叉狀或樹枝狀分支，一般較細，第三天生長最快，平均長速為 0. 8cm/d，第七天到第十四天長滿整個培養(yǎng)皿。
[0025] ⑶ITS序列分析 采用供試野生巨大口蘑子實體與實施例1獲得的對應(yīng)的巨大口蘑純化試管種菌絲，分 別按CTAB法提取基因組DNA，進行PCR擴增及ITS序列測定，通過Blast對比樣品的ITS序 列與NCBI中的巨大口蘑（I 序列Identities=585/589 (99%)，Gaps= 2/589 (0%)，分析確定實施例1分離得到的巨大口蘑純化試管種即新的巨大口蘑菌株為巨大口蘑 菌絲體。其具體方法如下： 改良CTAB法流程 i稱取0. 12g左右的干燥樣品，加入液氮并迅速研磨至粉狀后，迅速加入-σΓΑΒ50〇μ1、β-巰基乙醇2〇μ1，再加+CTAB(65°C預熱）70〇μ1，混勻后置65°C水浴振蕩抽提60min; ii冷卻，12000r離心lOmin，取上清液，加入700μ1等體積的苯酚/氯仿（1:1 )，混勻后 12000r離心lOmin; iii取上清，加入700μ