Ke修飾的5-氟尿嘧啶，其制備，納米結構，活性及應用
【專利說明】KE修飾的5-氟尿嘧陡，其制備，納米結構，活性及應用 發明領域
[0001] 本發明涉及5-氟尿啼陡-1-基乙酰-Lys-Glu及其制備方法，Lys-Glu的正規簡 稱是KE。涉及它的納米結構及它的體內外抗腫瘤作用，涉及它抗腫瘤細胞粘附侵襲和遷移 的作用。因而本發明涉及它在制備抗腫瘤藥物，制備抗腫瘤細胞遷移粘附和侵襲藥物中的 應用。本發明屬于生物醫藥領域。
【背景技術】
[0002] 5-氟尿嘧啶是一臨床常用的抗腫瘤藥物，它可用于多種癌癥的治療，胃癌，肝癌， 結腸等。雖然5-氟尿嘧啶對于腫瘤的治療有不錯的療效，但其也存在一些不容忽視的問 題。例如體內半衰期短，口服生物利用度低，給藥劑量與中毒劑量相近，毒副作用大。為了 能更好地發揮5-氟尿嘧啶的抗腫瘤作用，提高其抑瘤效果、減少毒副作用。多年來人們對 5_氟尿嘧啶進行了大量的修飾工作，合成了多種5-氟尿嘧啶衍生物，如在5-氟尿嘧啶上引 入葡萄糖、葉啉類化合物，金屬配合物，氨基酸和短肽等。遺憾的是這些努力并沒有獲得期 待的結果。在5-氟尿嘧啶的結構修飾中，還有將RGD三肽引入的合成研究。因為在一些重 要的研究中，R⑶三肽已確認對整合素受體沒有識別作用，所以這種修飾是一種目標含糊的 化學工作，對5-氟尿嘧啶沒有任何生物學意義。
[0003] RGD四肽，即RGDS，RGDF和RGDV是整合素α νβ3的阻斷劑，具有抗血栓和抗細胞 粘附活性。圖1是發明人創造的結構類型的代表。盡管發明人付出了大量研究精力，篩選 了數百種化合物，一直沒有得到同時具有抗腫瘤和抗腫瘤粘附浸潤和遷移作用的化合物。
[0004] 發明人在分析數百種化合物的結構及活性變化的基礎上，認識到將ΚΕ與5-氟尿 啼陡偶聯，形成的5-氟尿啼陡-1-基乙酰-Lys-Glu會同時具有抗腫瘤和抗腫瘤細胞粘附 浸潤和遷移作用。基于這個認識，發明人提出了本發明。
【發明內容】
[0005] 本發明的第一個內容是提供下面結構的5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Lys-Glu。
[0006] 本發明的第二個內容是提供5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Lys-Glu的制備方法，該方 法由以下步驟構成：
[0007] (1)60°C5-氟尿嘧啶在溴乙酸乙酯溶液，30%NaOH的水溶液中反應10h，然后在冰 水浴，濃鹽酸存在下形成5-氟尿嘧啶-1-基乙酸；
[0008] (2)采用液相合成制備Lys(Z)-Glu(0Bzl)_0Bzl;
[0009] (3)將1^8(2)-6111((?21)-(?21與5-氟尿嘧啶-1-基乙酸偶聯，制備5-氟尿嘧 陡 _1_ 基乙醜-Lys(Z)_Glu(OBzl) _0Bzl;
[0010] (4)將5-氟尿啼陡-1-基乙醜-Lys(Z)-Glu(OBzl)-〇Bzl脫保護，制備5-氟尿啼 啶-1-基乙酰-Lys-Glu。
[0011] 本發明的第三個內容是評價5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Lys-Glu的抗細胞增殖活 性。
[0012] 本發明的第四個內容是評價5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Lys-Glu對荷S180小鼠腫 瘤增長的抑制作用。
[0013] 本發明的第五個內容是評價5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Lys-Glu抗腫瘤細胞粘附， 侵襲和遷移作用。
【附圖說明】
[0014] 圖1.發明人創造的抗腫瘤活性化合物的結構類型代表。
[0015] 圖 2. 5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Lys-Glu的合成路線·i)DCC，HOBt，NMM，THF;ii) 氯化氫/乙酸乙酯溶液（4N) ;iii)TFA，TFMSA;iv)Na0H(30% )，60°C，溴乙酸乙酯，濃HC1。
[0016] 圖3. 5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Lys-Glu在純水溶液中1X10 5M濃度下的透射電鏡 照片。
【具體實施方式】
[0017] 為了進一步闡述本發明，下面給出一系列實施例。這些實施例完全是例證性的，它 們僅用來對本發明進行具體描述，不應當理解為對本發明的限制。
[0018] 實施例1制備5-氟尿嘧啶-1-基乙酸
[0019] 1. 30g(10mmol)5-氟尿嘧啶置于100mL茄瓶中，加入10mLNa0H(30% )的水溶液 溶解，將反應加熱升溫至60°C，待完全溶解，緩慢滴加1. 75mL溴乙酸乙酯溶液，恒溫60°C 反應12h，TLC(乙酸乙酯：冰醋酸：水=5 : 2 : 0. 5)顯示反應完成。將反應液冷卻至 室溫，冰浴下緩慢滴加濃鹽酸，調節pH至2,攪拌0. 5h，有無色固體析出，過濾，將濾餅分別 用冰水和乙醚洗三次，陰涼處晾干，得0. 56g(30% )標題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/ e) :189 [Μ+Η]+· 4NMR(500MHz，DMS0-d6) :δ/ppm= 13.21 (s，lH)，11.89 (d，J= 4. 5HzlH)， 8. 07(d，J= 6. 5HzlH)，4. 37(s，2H)。
[0020]實施例 2 制備Boc-Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl
[0021] 3. 83g(10mmol)Boc-Lys(Z)用20mL無水THF溶解于250mL反應瓶中，冰浴下加入 1. 48g(l.lmmol)N_ 羥基苯駢三氮唑（HOBt)及 2. 47g(l. 2mmol)二環己基碳二亞胺（DCC)， 攪拌30min得到反應物A。另將5. 17gTos*Glu(OBzl) -OBzl用20mL無水THF溶解于250mL 反應瓶，冰浴下緩慢滴加N-甲基嗎啉（NMM)調節pH至9,得到反應物B。冰浴下，將反應物B 加入反應物A中，緩慢滴加N-甲基嗎啉（NMM)調節pH至9,室溫下攪拌反應12h，薄層層析 TLC(石油醚：丙酮=4 : 1)顯示反應完成。反應液過濾，減壓除去溶劑，殘留物柱層析分 離（石油醚-丙酮系統），制得 4. 20g(54.0%)。Boc-Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl。ESI-MS(m/ e):691[M+H]+〇
[0022] 實施例 3 制備HC1 ·Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl
[0023] 冰水浴下，· 20gg(5. 4mmol)Boc-Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl與 25mL氯化氫的乙酸乙 酯溶液（4N)，室溫攪拌反應2h，薄層層析TLC(二氯甲烷：甲醇：冰醋酸=20 : 1 : 0.1) 顯示反應完成。減壓濃縮除去乙酸乙酯，殘留物反復用少量乙醚進行減壓濃縮以除去氯化 氫，制得2·88g(90·0%)HCl·Lys(Z)-Glu(0Bzl)-0Bzl。ESI-MS(m/e):589[M-H]。
[0024] 實施例 4 制備 5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl(2)
[0025] 0. 90g(4. 8mmol)5-氟尿嘧啶-1-基乙酸用15mL無水DMF溶解于100mL反應瓶中， 冰浴下加入0. 71g(5. 28mmol)N-羥基苯駢三氮唑（HOBt)及1. 19g(5. 76mmol)二環己基碳二 亞胺（DCC)，攪拌 30min得到反應物A。另將 2.88g(4.8mmol)HCl?LysO-GliKOBzD-OBzl 用20mL無水DMF溶解于100mL反應瓶，冰浴下緩慢滴加N-甲基嗎啉（NMM)調節pH至9， 得到反應物B。冰浴下，將反應物B加入反應物A中，緩慢滴加N-甲基嗎啉（NMM)調節pH 至9,室溫下攪拌反應12h，薄層層析TLC(二氯甲烷：甲醇：冰醋酸=15 : 1 : 0.1)顯 示反應完成。反應液過濾，減壓除去溶劑，殘留物柱層析分離（二氯甲烷-甲醇系統）， 制得0·30g(0·93%)5-氟尿嘧啶-l-基乙酰-Lys(Z)-Glu(0Bzl)-0Bzl，ESI-MS(m/e): 761[M+H]VH-匪R(300MHz，DMS0-d6) :δ/ρρπι= 8.45-8.33(m，2H)，8.17-8.14(d，lH)， 7. 62-7. 06 (m，15H)，6. 85 (m，1H)，5. 14-5. 00 (m，6H)，4. 38-4. 26 (m，4H)，2. 94-2. 90 (m，2H)， 2. 88-2. 76 (m，2H)，2. 38-2. 36 (m，2H)，2. 15-1. 82 (m，3H)，1. 60-0. 96 (m，7H)。實施例 7 制備 5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Lys-Glu(3)
[0026] 冰浴下 0· 37g(0· 40mmol) 5-氟尿嘧啶-1-基乙酰-Lys(Z)-Glu(OBzl)-OBzl(2)溶 解于lOmL三氟乙酸中，得到的溶液加入2mL三氟甲磺酸（TFMSA)，攪拌反應1. 5h，薄層層析 TLC(二氯甲烷：甲醇：冰醋酸=10 : 1 : 0. 1)及（乙酸乙酯：冰醋酸：水=5 : 2 : 1) 顯示反應完成。冰浴下，往反應化合物中加入大量無水乙醚，攪拌至有無色固體析出，過濾， 濾餅用蒸餾水溶解，氨水（10% )調節pH至6,用C18進行柱分離，得到0. 013g(37% ) 5-氟 尿嘧啶-1-基乙酰-Lys-Glu。ESI-MS(m/e) :446[M+H]+.mp:193. 5-195. 2 °C;[a]D25 =-27.31(c= 0·1，CH30H).IR(KBr) :3360,3219,2960,1680,1541，1463,1261，1091，1008， 794em^-NMR(300MHz,DMS0 ：D20 = 4 ： 1) ：δ/ppm= 8. 03-8. 01 (m, 1H)4. 42-4. 32 (m, 2H)，4. 09-4. 07 (m，2H)，2. 96-2. 86 (m，2H)，2. 27-2. 15 (m，2H)，1. 80-1. 78 (m，1H)， 1. 60-1. 55(m，2H)，1. 39-1. 13(m，2H).純度：100 % 流動相：CH30H:H20 :冰醋酸= 95 : 5 : 0· 1 保留時間：4. 68min。
[0027] 實驗例1測定化合物3的透射電鏡照片
[0028] 將化合物3按照1X10 5M的濃度配置化合物的純水溶液，均勻的鋪在銅網上，在 透射電鏡（TEM，JEM-1230，JE0L)下觀察化合物的自組裝性質。得到的照片如圖3。結果表 明，化合物3在水中均可形成納米顆粒，直徑在40-400nm。
[0029] 實驗例2測定化合物3對細胞的細胞毒作用
[0030] 1)本發明的化合物3用含0. 1 %DMS0的培養基配制成所需濃度。
[0031] 2)實驗用的腫瘤細胞為!fepG2 (人肝細胞癌細胞），HL60(人早幼粒細胞白血病細 胞），BEL-7402 (人肝癌細胞），MCF-7 (人乳腺癌細胞），HeLa(人宮頸癌細胞），U-20S(人 骨肉瘤細胞），S180 (小鼠腹水瘤細胞），L02 (人正常肝細胞）和Haca-T(人表皮正常細胞 株）。
[0032] 3)實驗方法HL-60,BEL-7402,MCF-7 和S180 細胞選用RPMI-1640 培養基；HeLa， !fepG2，U-20S，L02和Haca-T細胞選用DMEM培養基。培養基中均含10%經滅活的胎牛血清 和1X105U/L青霉素和100mg/L鏈霉素。
[0033] 貼壁細胞Η印G2,MCF-7,BEL-7402,HeLa，Haca-T，U-20S和半貼壁細胞S180 的培 養：分別將生長狀態良好，處于對數生長期的細胞以3X104個/mL的密度接種于96孔板， 每孔100μL，置于37°C和5 %C02的細胞孵育箱中培養4小時，然后按預設的濃度梯度加 入經滅菌處理的化合物3與含0. 1 %DMS0的培養基配制成的溶液，每孔25μL，對照組加入 等體積的溶解樣品的溶媒。繼續培養48小時后，每孔加25μL濃度為5mg/mL的MTT溶液， 置于37°C和5%C02的細胞孵育箱中培養4小時。小心除去上清液后每孔加入100μL的 DMSO,振蕩約lOmin溶解紫色殘留物（甲瓚），立即于酶標儀上檢測0·D.(吸光度）值，波長 為 570nm。
[0034] 懸浮細胞HL60的培養：分別將生長狀態良好，處于對數生長期的細胞以5X104個 /mL的密度接種于96孔板，每孔100μL，然后按預設的濃度梯度加入經滅菌處理的化合物 3與含0. 1%DMSO的培養基配制成的溶液，每孔25μL，對照組加入等體積的溶解樣品的溶 媒，置于37°C和5%C02的細胞孵育箱中培養48小時。每孔加入25μL濃度為5mg/mL的 MTT溶液，繼續置于條件為37°C和5%C02的細胞孵育箱中培養4小時。2500rpm離心lOmin， 小心吸出上清液，每孔加入lOOyLDMSO,振蕩約lOmin溶解紫色殘留物（甲瓚），立即于酶 標儀上檢測〇·D