紅霉素半抗原、人工抗原和抗體及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及選擇一種具有一C00H的、又最大可能包含紅霉素原有結構的化合物作 為紅霉素半抗原，以此半抗原制成的人工抗原、特異性抗體；以及此類半抗原、人工抗原、特 異性抗體的用途，和半抗原、人工抗原、抗體的制備方法。
【背景技術】
[0002] 紅霉素（ErythromycinA)屬大環內酯類抗生素，對葡萄球菌、各種鏈球菌和革蘭 氏陽性桿菌均具有抗菌活性，主要用于抗畜禽細菌及支原體感染，亦可用作豬的飼料添加 劑以促進增重和提高飼料轉換率，在畜禽、水產品養殖及其疾病治療過程中應用廣泛。但是 紅霉素能對機體產生一些副作用，如胃腸道反應、膽汁郁積性黃疸以及靜滴時引起靜脈炎， 還能引起壞死性肝病、精神障礙和關節炎綜合癥等，因此，紅霉素在生產上的大量使用會由 于其在動物體內代謝時間較長而在畜禽組織、蜂蜜、牛奶、魚蝦等產品中的殘留，危害公眾 健康。目前世界各國為保證食品安全，對紅霉素的使用和紅霉素在食品中的殘留限量進行 了規定，我國農業部235號公告中規定紅霉素的最大殘留限量為動物組織200yg/kg，奶 40μg/kg，蛋 150μg/kg。
[0003]目前對紅霉素的研究主要集中在醫藥領域，食品中紅霉素殘留的相應檢測方法 研究報道較少，且多為儀器檢測，如薄層色譜法、液相色譜法、液相色譜-質譜法、氣相色 譜-質譜法等。儀器檢測法存在樣品前處理繁瑣、檢測時間長、儀器貴重等缺點，所以在我 國無法得到廣泛應用，并且不符合現場檢測"在短時間內低成本對大量樣品進行準確檢測 和篩選"的要求。酶聯免疫吸附測定技術Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay(ELISA)，是 將免疫技術與現代測試手段相結合而建立的一種超微量的測定方法，具有成本低、速度快、 靈敏度高、儀器設備簡單的特點，適合大批量樣品的快速分析。而免疫學檢測方法的基礎是 相應的高特異性、高親和力的抗體的制備，而紅霉素作為小分子化合物，本身不具備免疫原 性，因此，其半抗原的結構改造和全抗原合成是建立免疫速測技術的關鍵和難點之一。
【發明內容】
[0004] 針對現有技術中存在的不足之處，本發明提供一種能最大程度保留紅霉素的化學 結構，又具有一定長度連接臂的半抗原以及這種半抗原的制備方法；以此半抗原制備的人 工抗原、檢測靈敏度高和特異性強的抗體；以及此半抗原、抗體的用途。
[0005] 本發明為達到以上目的，是通過這樣的技術方案來實現的：提供一種紅霉素半抗 原，它的分子結構式為 ：
[0006]
[0007] 本發明的半抗原以紅霉素為起始原料，先與溴乙酸叔丁酯反應生成中間體，再與 甲酸反應生成羧甲基紅霉素，即為紅霉素半抗原。反應式如下：
[0008]
[0009] 本發明的紅霉素半抗原的制備方法進一步描述如下：
[0010] 1)向100mL兩口燒瓶中加入0· 5g溴乙酸叔丁酯、0· 90g紅霉素和10mL丙酮，加熱 至輕微回流，反應20h后，抽濾白色固體；
[0011] 2)向步驟1)所得固體粉末中加入lOmL四氫呋喃和lOmL甲酸，室溫反應20h，蒸 除溶劑得到羧甲基紅霉素，即為紅霉素半抗原。
[0012] 上述方法制得的紅霉素半抗原，具有紅霉素特征結構的同時又具有可以與蛋白質 偶聯的一C00H結構。
[0013] 本發明還提供了一種依靠上述紅霉素半抗原制得的紅霉素人工抗原，它的分子結 構式為：
[0014]
[0015] 本發明的紅霉素人工抗原的制備方法描述如下：
[0016] 1) 18mg紅霉素半抗原溶于lmLN,N-二甲基甲酰胺中；
[0017] 2) 30mg碳化二亞胺和30mgN-羥基琥珀酰亞胺用0· 2mL水充分溶解后加入到步驟 1)紅霉素半抗原溶液中，室溫攪拌24h;
[0018] 3) 50mg載體蛋白充分溶于3. 8mLPBS(pH7. 2)中，將步驟2)所得溶液逐滴緩慢加 入到蛋白洛液中，室溫攬泮24h;
[0019] 4)待上述反應完成后，裝入透析袋中，0.Olmol/LPBS緩沖液中4°C透析3d，每天 換透析液3次，透析完成后凍干，-20°C保存備用。
[0020] 所述載體蛋白可為牛血清白蛋白（BSA)、人血清蛋白（HSA)、血藍蛋白（KLH)或卵 清蛋白（0VA)，優選牛血清白蛋白（BSA)。
[0021] 本發明還提供了一種紅霉素特異性抗體，是用分子結構式為
的紅霉素人工抗原免疫白鼠所得到 的、能與紅霉素發生特異性免疫反應的單克隆免疫球蛋白G。
[0022] 本發明同時提供了上述紅霉素半抗原的用途，是用作動物免疫的抗原體系的原 料。
[0023] 本發明同時提供了上述紅霉素特異性抗體的用途，用于檢測食品中紅霉素類化合 物的殘留量。
[0024] 所述紅霉素類化合物為紅霉素、硫氰酸紅霉素和琥乙紅霉素中的至少一種。
[0025] 基于紅霉素內酯環結構可能是其活性官能團，以紅霉素為原料，經過兩步反應，分 別與溴乙酸叔丁酯、甲酸反應，引入不同的"連接臂"合成了半抗原，最大可能保留了原來紅 霉素的分子結構，使紅霉素分子的化學結構與電子分布幾乎不受影響，這為獲得對紅霉素 有高度特異性的抗體提供了保證。
[0026] 本發明中合成的紅霉素半抗原化合物為國內外首創的新化合物，既最大程度地保 留了紅霉素的化學結構，又具有一定長度的連接臂，用這一半抗原制備的免疫抗原去免疫 動物，所得的抗體的效價、特異性、親和力都比較好，所得的抗體用于ELISA方法檢測紅霉 素類化合物，靈敏度可達〇. 2μg/L，與其他大環內酯類抗生素的交叉反應率低。
【附圖說明】
[0027] 圖1紅霉素半抗原合成路線圖
[0028] 圖2紅霉素半抗原核磁共振氫譜圖
[0029] 圖3紅霉素ELISA競爭標準曲線圖
【具體實施方式】
[0030]下面結合附圖和具體實施例進一步詳細說明本發明。下述實施例中所使用的實驗 方法如無特殊說明，均為常規方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業途徑 得到的試劑和材料。
[0031] 實施例1 :半抗原合成和鑒定
[0032]-種紅霉素半抗原，分子結構式為：
[0033]
[0034] 是用作動物免疫的抗原體系的原料。
[0035] 上述紅霉素半抗原的制備方法如下（合成路線見附圖1):
[0036] 1)向100mL兩口燒瓶中加入0· 5g溴乙酸叔丁酯、0· 90g紅霉素和10mL丙酉同，加熱 至輕微回流，反應20h后，抽濾白色固體；
[0037] 2)向步驟1)所得固體粉末中加入10mL四氫呋喃和10mL甲酸，室溫反應20h，蒸 除溶劑得到羧甲基紅霉素，即為紅霉素半抗原。
[0038] 產物的鑒定：
[0039] 取上述目的產物經核磁共振氫譜鑒定，見附圖2所示。圖譜中11.Oppm增加的羧 基峰說明紅霉素半抗原合成成功。
[0040] 實施例2 :人工抗原合成和鑒定
[0041] 由實施例1所述紅霉素半抗原制成的一種紅霉素人工抗原，分子結構式為：
[0042]
[0043] 1、免疫原的合成
[0044] 免疫原的合成利用碳化二亞胺法，制備方法如下：
[0045] 1) 18mg紅霉素半抗原溶于lmL N,N-二甲基甲酰胺中（DMF);
[0046] 2) 30mg碳化二亞胺（EDC)和30mgN-羥基琥珀酰亞胺（NHS)用0· 2mL水充分溶解 后加入到步驟1)紅霉素半抗原溶液中，室溫攪拌24h ;
[0047] 3) 50mg牛血清白蛋白（BSA)充分溶于3. 8mLPBS(pH7. 2)中，將步驟2)所得溶液 逐滴緩慢加入到蛋白溶液中，室溫攪拌24h;
[0048] 4)待上述反應完成后，裝入透析袋中，0.Olmol/LPBS緩沖液中4°C透析3d，每天 換透析液3次，透析完成后凍干，-20°C保存備用。
[0049] 人工抗原的鑒定：
[0050] 按合成紅霉素免疫原反應所用半抗原、載體蛋白與偶聯產物的比例，進行紫外 (200nm~400nm)掃描測定，通過比較三者分別在260nm和280nm的吸光值計算其結合比。 偶聯物紅霉素半抗原-BSA的最大吸收峰與紅霉素半抗原、BSA的最大吸收峰相比發生了明 顯的變化，表明人工抗原紅霉素半抗原-BSA的合成是成功的。經計算，半抗原與BSA的結 合比為15:1。
[0051] 2、包被原的合成
[0052] 包被原的合成也利用碳化二亞胺