(3s,6r)-3,6二取代哌嗪-2,5-二酮,其制備及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及了下面結構式所示的小分子U-PA抑制劑，涉及它的制備方法和作為 u-PA抑制劑在抑制腫瘤侵襲和遷移、止血和抗炎方面的應用。本發明屬于生物醫藥領域。
[0002]
【背景技術】
[0003] 纖溶酶原激活系統由纖溶酶原激活劑（Pas)，纖溶酶原激活抑制劑（PAIs)和細胞 外纖溶酶原激活劑受體（PAR)組成。纖溶酶原激活系統涉及細胞遷移，血管生成，傷口愈 合，胚胎發育，腫瘤細胞擴散和轉移等一系列過程。在哺乳動物體內主要有組織型纖溶酶原 激活劑（t-PA)和尿激酶型纖溶酶原激活劑（u-PA)兩種纖溶酶原激活劑。
[0004] 尿激酶型纖溶酶原激活劑（U-PA)是從人尿或腎細胞組織培養液中提取的一種絲 氨酸蛋白酶，屬雙鏈尿激酶型纖溶酶原活化劑（tcu-PA)，分子量為55000或33000,是外源 性纖維溶解系統的激活劑。u-PA可以直接裂解纖溶酶原的精氨酸（560)-纈氨酸（561)肽 鍵，使無活性的單鏈纖溶酶原轉變為有活性的雙鏈纖溶酶。
[0005] 在腫瘤組織中，u-PA激活纖溶酶原轉化為纖溶酶，纖溶酶直接或間接造成細胞外 基質降解，進一步導致腫瘤細胞的浸潤，轉移和血管生成，促進腫瘤的增殖。在血液循環中， u-PA通過激活纖溶酶原參與調節血管內凝血-纖溶的平衡，對抑制血栓起重要作用。
[0006] 在炎癥應答過程中，U-PA通過與炎癥細胞表面的U-PAR結合，參與調節炎癥細胞 對血管和組織的滲透能力，促進炎癥細胞向炎癥部位遷移，促進炎癥反應以及炎癥因子的 釋放，而炎癥因子的釋放又會誘導u-PA表達上升。
[0007] 由于u-PA的酶活性貫穿在腫瘤-纖溶-炎癥復雜的交叉聯系中，所以影響u-PA 的活性會影響復雜的交叉聯系。也就是說，發明優秀活性的u-PA抑制劑對于抑制u-PA在 腫瘤-血栓-炎癥交叉聯系有重要意義。這種意義體現在70%以上癌癥病人死于癌轉移； 有大約10%的癌癥晚期病人出現出血癥狀，例如出現幾乎無法預測鼻，咽，肺或胃腸道大 出血；摘除腫瘤手術發生的出血，也惡化病人的預后。針對這種狀況，本發明提出了（3S， 6S) -3- (4- 丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮，其制備及治療作用。
[0008] 此前，發明人曾報道下面結構的二酮哌嗪包括CIPPC是u-PA抑制劑（結構見圖 1)，有優秀的止血活性。lnmol/kg劑量下，CIPPC能顯著降低小鼠鼠尾出血時間[33,34]。 不幸的是，在l〇nmol/kg劑量下CIPPC能促進血栓生成。血栓是腫瘤本人重要的并合癥，是 造成腫瘤本人死亡的重要因素。CIPPC能促進血栓生成的作用為腫瘤病人帶來了新的威脅。 對比之下，（3S，6R) -3- (4- 丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮的意想不到的優 勢是，除了與CIPPC-樣有優秀的止血活性外，還有抑制腫瘤細胞浸潤和轉移，抑制腫瘤本 人并發炎癥作用，同時不會引起血栓形成。
【發明內容】
[0009] 本發明的第一個內容是提供下面結構式的u-PA抑制劑（3S，6R)-3_(4-丁氨 基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮；
[0010]
[0011] 本發明的第二個內容是提供（3S，6R)-3-(4-丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌 嗪-2, 5-二酮的制備方法，該方法包括下面四個反應步驟：
[0012] (1)在DCC和HOBt存在下L-Trp-〇Bzl在無水四氫呋喃中與L-Boc-Lys(Z)縮合為 D-Boc-Lys(Z)-L-Trp-〇Bzl；
[0013] (2)在氯化氫-乙酸乙酯溶液中D-Boc-Lys(Z) -L-Trp-OBzl脫去Boc生成 D-Lys(Z)-L-Trp-〇Bzl；
[0014] (3)在乙酸乙酯和 5 %NaHC03 存在下D-Lys(Z)-L-Trp-〇Bzl生成（3S， 6R)-3-(4-丁氨基芐基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮；
[0015] (4)在Pd/(^PH2存在下，在甲醇中（3S，6R)-3-(4-丁氨基芐基）-6-(吲哚-3-乙 基）-哌嗪-2，5-二酮反應生成（3S，6R) -3- (4- 丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2， 5-二酮。
[0016] 上面的四個反應步驟可以用圖2的合成路線描述。
[0017] 本發明的第三個內容是評價小分子u-PA抑制劑（3S，6R)-3-(4- 丁氨基）-6-(吲 哚-3-乙基）_哌嗪-2, 5-二酮在抑制腫瘤細胞侵襲和轉移方面，以及止血和抗炎等方面的 作用。
【附圖說明】
[0018] 圖1此前發明人報道的u-PA抑制劑二酮哌嗪CIPPC的結構。
[0019] 圖2合成（3S，6R)-3-(4-丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮的路線 1.i)DCC,H0Bt,NMM,THF；ii)HCl/EA(4N) ；iii)EA, 5%NaHC03(3a)orEA,TEA, 80°C(3b, 3c)； iv)CH30H,Pd/C,H2。
[0020] 圖3 (3S，6R)-3-(4-丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮在體外對UK 激活纖溶酶原活力的影響。其中1列為單組分的人纖溶酶原（PLG)，2列為UK與PLG的 共孵育；3列為100μg(3S，6R)-3-(4-丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮和 5μLUK(400U/mL)與 5μLPLG(5mg/mL)的共孵育組分；4 列為 50μg(3S，6R)-3-(4-丁氨 基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮和 5μLUK(400U/mL)與 5μLPLG(5mg/mL)的共孵 育組分；5列為10μg(3S，6R) -3- (4- 丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮和5μL UK(400U/mL)與 5μLPLG(5mg/mL)的共孵育組分；6 列為 500μg的EACA和 5μLUK(400U/ mL)與 5μLPLG(5mg/mL)的共孵育組分；7 列為 250μg的EACA和 5μLUK(400U/mL)與 5μL PLG(5mg/mL)的共孵育組分。
【具體實施方式】
[0021] 為了進一步闡述本發明，下面給出一系列實施例。這些實施例完全是例證性的，它 們僅用來對本發明進行具體描述，不應當理解為對本發明的限制。
[0022] 實施例 1 制備D-Boc-Lys(Z) -L-Trp-OBzl(1)
[0023] 將1. 9g(5.Ommol)D-Boc-Lys(Z)混懸于20mL無水四氫呋喃，室溫攪拌下向溶液中 加入0. 675g(5. 0mmol)H0Bt，冰浴攪拌下加入1. 133g(5. 5mmol)DCC，得到反應液I，冰浴下 攪拌30分鐘。將1. 47g(5. 0mmol)L-Trp_0Bzl混懸于20mL無水四氫呋喃中，然后逐漸加入 NMM，調節pH至8-9,得到反應液II。將反應液II加入反應液I中，先在冰浴下攪拌lh，再在 室溫攪拌，TLC監測至原料點消失。后處理：減壓過濾除去DCU，將濾液減壓濃縮除去四氫呋 喃，殘留物用150mL乙酸乙酯溶解，將得到的溶液置于250mL分液漏斗中，依次用5%KHS04 水溶液洗和飽和NaCl水溶液各洗3次，乙酸乙酯層用無水Na2S04干燥30min，減壓過濾， 濾液減壓濃縮至干，得到的黃色泡狀物，經硅膠柱層析純化（CH2C12 :CH30H=100 : 1~ 20 : 1)，得到 2.863g(87.3%)標題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/e) :657[M+H] +。
[0024] 實施例 2 制備D-Lys(Z) -L-Trp-〇Bzl(2)
[0025] 將純品 2. 62g(4.Ommol)D-Boc-Lys(Z) -L-Trp-〇Bzl(1)置于 100mL茄瓶中，冰浴攪 拌下緩慢向反應瓶中滴加30mL4N氯化氫-乙酸乙酯溶液，加干燥管，冰浴攪拌下反應4小 時后TLC監測原料點消失，終止反應。后處理：攪拌下用水泵將反應液減壓抽干，加乙酸乙 酯溶解后再次用水泵減壓抽干，重復三次；加無水乙醚充分混懸后靜置，傾倒出乙醚，抽干 產物，重復三次，得2g(90.9%)標題化合物，為淡黃色粉末。ESI-MS(m/e) :557[M+H] +。
[0026] 實施例3制備（3R，6R)-3-(4-丁氨基芐基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二 酮⑶
[0027] 將1. 83g(3. 29mmol)化合物D-Lys(Z)-L-Trp-〇Bzl⑵以80mL乙酸乙酯溶解，用 三乙胺調pH至9,油浴80°C反應6小時，TLC顯示原料點基本消失。后處理：將反應液直接 用硅膠拌樣，硅膠柱層析純化（CH2C12:CH30H= 100:1-20:1)，得到1.28g(86.9%) 標題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/e) :449[Μ+Η]+·蟲NMR(300MHz，DMS0-d6):δ /ppm= 10. 89(s，1H)，8· 03(s，1H)，7· 85(s，1H)，7· 56(d，J = 9. 0Hz，1H)，7· 35(m，6H)，7· 19(t，J = 6. 0Hz, 1H) ,7. 05(m,2H) ,6. 95 (t, J = 6. 0Hz, 1H) ,4. 99(s,2H) ,4. 07 (s, 1H),3. 25 (dd, J = 3. 0Hz, J = 15. 0Hz, 1H),3. 09 (dd, J = 3. 0Hz, J = 15. 0Hz, 1H),2. 99 (s, 1H),2. 91 (q, J = 6. 0Hz，2H)，1. 48(m，2H)，1. 24(m，2H)，1. 16(m，2H)。
[0028] 實施例4制備（3R，6R)-3-(4-丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮（4)
[0029] 將 0. 12g(0. 26mmol)化合物（3R，6S) -3- (4- 丁氨基芐基）-6-(吲哚-3-乙 基）-哌嗪-2,5-二酮（3)置于50mL反應瓶中，加入10mL甲醇溶解，向溶液中加入30mg Pd/C，通入H2，室溫攪拌反應48小時，TLC顯示原料的基本消失，濾去Pd/C，減壓濃縮得 63mg(75% )標題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/e) :315[M+H]+.Mpl89-190°C·IR(KBr): 3250, 2860, 2312,1662,1456,1325,1230,1093,1006,736cm
Ο^Ο?Ο/ΗΜΚΟΟΟΜΗζ,ΟΜΒΟ-?^) :δ/ρρπι= 10.92(s，1H)，8.05(s，1H)，7.88(s，1H)， 7. 56(d,J= 9. 0Hz,lH),7. 31(d,J= 9. 0Hz, 1H), 7. 06 (s, 1H), 7. 04 (t,J= 9Hz,lH), 6. 94(t,J= 9Hz, 1H) ,4. 07 (s, 1H), 3. 26(dd,J= 3Hz,J= 12Hz, 1H), 3. 02(dd,J= 6.OHz,J =15Hz, 1H) ,2. 84(m,2H) ,2. 44(m,2H),1. 19(m,2H),l. 10 (m, 2H).13CNMR(200MHz,DMS0-d6)