用于高效率且高通量產生轉基因事件的改進的分割種子大豆轉化的制作方法
【專利說明】用于高效率且高通量產生轉基因事件的改進的分割種子大 豆轉化
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[0002] 本申請要求2012年12月19日提交的美國臨時申請61/739, 349的優先權，茲將 其全文援引并入本申請。
[0003] 對電子提交的序列表的援引
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技術領域 陽0化]本公開設及一般意義上的植物育種。提供了用于大豆轉化的方法。本公開的方法 可用于轉基因大豆的高效率并且高通量的生產，和轉基因大豆產品的產業開發。
[0006] 背景 陽007] 大豆（Glycinemax)是最重要的農業作物之一，全世界每年的作物產量超過2億 公噸，估計價值超過400億美元。大豆占全球油料種子生產的超過97%。因此，提高運種有 價值的作物的質量和產量的可靠而高效的方法具有顯著的利益。
[0008] 用于改良大豆的傳統育種方法已經受到限制，因為大部分的大豆栽培種僅源于少 數幾個親本系，導致種質育種基礎較窄。化'13如11等，1'18了6〇18:145-151(1990)。現時的 研究工作主要致力于在用植物基因工程技術來提高大豆產量。轉基因方法旨在將期望的基 因導入到作物植物的可遺傳種系中，W產生優良的植物品系。運種策略已經成功地增加了 其它幾種作物植物對疾病、昆蟲和除草劑的抗性，同時提高了營養價值。
[0009] 已經開發出了多種用于將基因轉移到植物組織中的方法，包括高速微噴射、顯微 注射、電穿孔和直接DNA攝取。最近，±壤桿菌介導的基因轉化已經被用于將感興趣的基因 導入到大豆中。然而已經證明，大豆對轉基因工程而言是一個具有挑戰性的系統。大豆外 植體的高效轉化和再生是難W實現的，并且經常難W重復。
[0010] 根癌±壤桿菌是一種致病性的±棲細菌，具有將其DNA(稱為T-DNA)轉移到宿主 植物細胞內、并誘導宿主細胞產生可用于細菌營養的代謝物的固有能力。使用重組技術，可 W將一些或全部的T-DNA用感興趣的基因取代，產生可用于轉化宿主植物的細菌載體。± 壤桿菌介導的基因轉移通常針對組織培養物中未分化的細胞，但也可W針對從植物葉片或 莖獲取的已分化細胞。已經開發了多種用于大豆的±壤桿菌介導的轉化方法，它們可W根 據被轉化的外植體組織松散地分類。
[0011] 美國專利No. 7, 696, 408,0化oft等人公開了一種子葉節k〇t}dedonarynode)方 法，用于轉化單子葉植物和雙子葉植物。"子葉節"方法設及從5-7日齡大豆幼苗通過在子 葉節的正下方切割除去下胚軸，切開并分離剩余的帶有子葉的下胚軸節段，并從子葉除去 上胚軸（epicotyl)。將子葉外植體在蔽芽和/或子葉節的區域中造傷口（wounded)，并與根 癌±壤桿菌在黑暗中培養五天。該方法需要在體外萌發種子，并且制造傷口步驟（wounding step)會引入顯著的變數。
[0012] 美國專利No.6, 384, 301，Martinelli等人公開了向來自從大豆種子切下的大豆 胚的活分生組織中進行±壤桿菌介導的基因傳遞，隨后用選擇劑和激素培養分生外植體， 并誘導芽形成。與"子葉節"方法相似，優選地在感染之前對分生外植體致傷。
[0013] 美國專利No. 7, 473, 822,Paz等人公開了一種改良的子葉節方法，稱作"半種子外 植體"法。使成熟的大豆種子吸脹，表面滅菌，并沿著種廝切開。在感染之前，胚軸和芽被完 全除去，但沒有其它的傷口出現。進行±壤桿菌介導的轉化，選擇潛在轉化體，并在選擇培 養基上再生外植體。
[0014] 使用運些方法的轉化效率仍然相對較低，"子葉節"法在0.3% -2.8%的量級，"分 生外植體"法為1. 2-4. 7% /'半種子外植體"法為3. 2% -8. 7% (整體4. 9% )。本領域的 典型轉化效率為大約3%。
[0015] 改良的"分割種子"轉基因程序可W加速未來轉基因大豆產品的生產和開發。用 于將轉基因穩定整合到大豆組織中的高效且高通量的方法將促進育種進程，并具有提高作 物的產量的潛力。
[0016] 公開概要
[0017] 本公開設及轉化植物細胞的方法。更具體地，本公開設及用于轉化大豆（Glycine max)的方法，其使用±壤桿菌介導轉化分割的（split)大豆種子，其中分割的大豆種子保 留一部分胚軸。
[0018] 在一個實施方案中，本公開設及一種產生轉基因事件的方法，包括將切割工具插 入大豆種子的種皮W產生第一子葉節段和第二子葉節段，用±壤桿菌接種包括部分胚軸的 該第一子葉節段，所述±壤桿菌包括至少一個轉基因，并培養經接種的子葉節段W在經轉 化的植物細胞中產生轉基因事件。
[0019] 在另一個實施方案中，本公開設及一種產生轉基因事件的方法，該方法包括將切 割工具插入大豆種子的種皮W產生包含部分胚軸的子葉節段，用上壤桿菌接種包含該部分 胚軸的子葉節段，所述±壤桿菌包含至少一個轉基因，并培養經接種的子葉節段W在經轉 化的植物細胞中產生轉基因事件，并從該經培養的接種子葉節段產生完整、能育的植物，該 完整、能育的植物包含所述轉基因事件。
[0020] 附圖簡述
[0021] 圖1是大豆種子的俯視圖。
[0022] 圖2是圖1的大豆種子的側視圖。
[0023] 圖3是圖1的大豆種子的沿3-3線截取的剖視圖。
[0024] 圖4是與圖3相似的視圖，顯示切割工具與大豆種子的部分胚軸的交會。
[0025] 圖5是圖1的大豆種子的沿5-5線截取的剖視圖。顯示切割工具順著大豆的縱軸 插入大豆中。 陽0%] 圖6是一對子葉節段的俯視圖。
[0027] 圖7顯示了PDAB9381的質粒圖，依照具體的實施方案，該構建體可用于±壤桿菌 介導的大豆外植體的轉化。
[0028] 圖8顯示了PDAB107533的質粒圖。
[0029] 圖9顯示了描繪在不同比例的草甘麟下有至少一半子葉變黃的外植體的百分比 的圖。
[0030]圖10顯示了PDAB105958的質粒圖。 陽0川序列表
[0032] 附隨的序列表中列舉的核酸序列是使用如37C.F.R. § 1. 822定義的核巧酸堿基 的標準字母縮寫顯示的。僅顯示了每個核酸序列的一條鏈，但是應當理解的是，任何對所顯 示的鏈的提述包括了互補鏈。在附隨的序列表中：
[0033]SEQIDN0:1顯示了用于本公開的質粒構建體PDAB9381中的YFP植物轉錄單元 (PTU)〇
[0034]SEQIDN0:2顯示了用于本公開的質粒構建體PDAB9381中的PAT植物轉錄單元 (PTU)〇
[0035]SEQIDN0:3顯示了用于本公開的質粒構建體PDAB107553中的DGT-28植物轉錄 單元（PTU)。
[0036] 56〇10^:4顯示了用于本公開的質粒構建體9〇48107553中的？41'植物轉錄單元 (PTU)〇
[0037]SEQID^:5顯示了用于本公開的質粒構建體口048105958中的冊1'植物轉錄單元 (PTU)〇
[0038] SEQ ID N0:6顯示了用于本公開的質粒構建體pDAB105958中的PAT植物轉錄單元 (PTU)〇
[0039] 發明詳述
[0040] 本文公開了用于高效率且高通量地轉化大豆的方法。部署所公開的大豆轉化方法 所致的轉化頻率顯著高于先前已知的方法，并且可導致高達20. 3%的轉化頻率。該新型大 豆轉化系統的效率是其它方法（即"子葉節"法和"半種子外植體"法）的大約3-8倍，并 可作為提高轉基因大豆植物產業開發的基礎。
[0041] 一般地，本公開的實施方案設及一種用于轉化包含部分胚軸的分割的大豆種子的 新方法。該新型方法是對其它已知轉化方法的改良，導致高效產生轉基因大豆植物。
[0042] 在一個實施方案中，公開了一種用轉基因轉化大豆的新方法。本方法的實施方案 包括縱向分割大豆種子獲得分割的大豆種子，其中一部分胚軸保持附著在分割的大豆種子 上。接著，使用轉化方法用至少一個轉基因轉化該包含部分胚軸的分割的大豆種子。從被 轉化的包含部分胚軸的分割的大豆種子中選擇大豆轉化體。
[0043] 在本公開的一個實施方案中，在分割大豆種子之前，使大豆種子吸脹（imbibe)。大 豆種子可W吸脹14-16小時。此外，大豆種子可W吸脹其它備選的時長。例如，大豆種子可 W吸脹6, 7,8, 9, 10, 11，12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21，22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30， 31，32, 33, ：34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41，42, 43, 44, 45, 46, 47,或 48 小時的時間。
[0044] 在本公開的第二個實施方案中，大豆種子被沿著大豆種子的種廝縱向分割。
[0045] 在一個實施方案中，大豆種子被分割，使得胚軸仍然附著于大豆種子的節端 (nodalend)。大豆種子保留的胚軸可W包括胚軸種子結構的任何部分。運樣，在分割的大 豆種子時保留的任何部分或量的胚軸在本公開的范圍內。實施方案包括在分割的大豆種子 時保留的胚軸的任何部分，包括胚軸的任何全長部分（化11lengthpodion)或任何非整 體部分（partialportion)。例如，在分割的大豆種子時可保留1/4, 1/3, 1/2, 2/3, 3/4,或 完整的胚軸。
[0046] 在進一步的實施方案中，對保留部分胚軸的分割的大豆種子進行轉化，方法是用 攜帶一個或多個位于構建體內的轉基因的根癌±壤桿菌菌株接種該分割的大豆種子。額外 的實施方案可W包括其它的轉化方法。例如，高速微噴射介導的轉化法、顯微注射介導的轉 化法、電穿孔介導的轉化法、或直接DNA攝取介導的轉化方法，或者任何其他的植物轉化方 法，被認為在本公開的范圍內。
[0047] 在本公開的實施方案中，保留部分胚軸的分割的大豆種子被轉化，借此將轉基因 導入到大豆細胞內。將轉基因導入到大豆細胞內可W產生穩定轉化或瞬時轉化的大豆植物 細胞。在運一實施方案的一個方面中，一個或多個轉基因可W被轉化到大豆植物細胞中。在 進一步的實施方案中，轉基因包含啟動子、開放閱讀框、和3'非翻譯區。開放閱讀框可W編 碼基因，其中該基因是標志物基因、農藝基因、或任何其它類型的基因。
[0048] 在一個實施方案中，使用抗微生物選擇劑選擇被轉化的保留部分胚軸的分割的 大豆種子。抗微生物選擇劑的實例包括，但不僅限于，草錠麟（glu化sinate)、麟絲菌素、 2, 4-D、卡那霉素、和草甘麟。
[0049] 本公開的實施方案設及從包含部分胚軸的分割的大豆種子再生一個或多個外植 體。外植體的再生通常在選擇培養基上進行，但也可W在本領域已知的其他類型培養基中 進行。當成功再生外植體時，可W通過在合適的培養基上進行組織培養（例如"培養"）而 誘導形成一個或多個芽。作為本公開進一步的實施方案，該一個或多個芽可W被培養成完 整、能育的大豆植物。所述芽可包括被轉化的胚系細胞（germlinecell)。
[0050] 在本公開隨后的實施方案中，完整、能育、成熟的大豆植物可W和另一大豆植物有 性雜交，產生大豆后代植物。在本公開的另一個實施方案中，分離從轉化的包含部分胚軸的 分割的大豆種子產生的外植體，并將其推進到細胞-組織培養基中進行芽誘導（2周無選擇 和2周有選擇）、芽伸長（有選擇），和生根（無選擇）。推進轉基因大豆外植體經過運些 細胞培養階段后，將產生轉基因植物。通過分子分析確認轉基因植物含有穩定整合在大豆 基因組中的轉基因。然后令特定的轉基因大豆植物在溫室中生長至成熟。在實驗中，與子 葉法相似，45%的Τι后代被發現具有穩定整合的、可W被遺傳給后代大豆植物的轉基因拷 貝。該轉基因向后代的遺傳能力通過使用除草劑LIBERTY?的除草劑篩選和分子分析加W 確認。
[0051] 在另一個實施方案中，本公開設及一種產生轉基因事件的方法，包括將切割工具 插入大豆種子的種皮W形成第一子葉節段和第二子葉節段，用±壤桿菌接種包含部分胚軸 的第一子葉節段，所述±壤桿菌包括至少一個轉基因，并培養經接種的子葉節段W在經轉 化的植物細胞中產生轉基因事件。
[0052] 在一個實施方案中，所述方法包括在接種第一子葉節段之前從第一子葉節段和第 二子葉節段除去種皮。在一個進一步的實施方案中，所述方法包括插入切割工具并縱向切 割胚軸W保留部分胚軸與每個子葉節段在一起。在該實施方案的一個方面中，在插入切割 工具之前大豆種子的胚軸有一未切割長度，且第一子葉節段的部分胚軸的長度是該胚軸的 未切割長度的大約1/3至1/2。在該實施方案的另一個方面中，切割第一子葉節段的部分胚 軸W保持部分胚軸附著于第一子葉節段，且保留的部分胚軸的長度是胚軸的未切割長度的 約1/3至1/2。在該實施方案的一個進一步的方面，在插入切割工具之前大豆種子的胚軸具 有一未切割長度，且第一子葉節段的部分胚軸的長度與該未切割長度相等。
[0053] 在另一個實施方案中，插入切割工具包括沿著大豆種子的種廝縱向切割大豆種 子。在該實施方案的一個方面，定位大豆種子外表面上的種廝，并在插入切割工具之前使切 割工具相對于大豆種子定向，W使得切割工具與種廝對齊。在該實施方案的一個進一步的 方面，每個子葉節段包括部分種廝。在該實施方案的另一個方面，大豆種子具有延伸穿過種 廝的縱軸，該縱軸將大豆種子分為第一側和第二側。在該實施方案的一個進一步的方面，在 插入切割工具之前握住大豆種子的第一側。
[0054] 在下面的一個實施方案中，本公開設及在形成第一和第二子葉節段之前插入切割 工具并將切割工具推進大豆種子的胚軸內。在一個替代的實施方案中，形成第一和第二子 葉節段，然后插入切割工具并將切割工具推進大豆種子的胚軸內，產生保留長度為胚軸未 切割長度之分數（例如約1/3至1/2)的部分胚軸的第一子葉節段。 陽化5] 在一個進一步的實施方案中，本公開的方法包括從經培養的接種子葉節段產生完 整、能育的大豆植物，所述完整、能育的大豆植物包括所述轉基因事件。在該實施方案的一 個方面，所述完整、能育的大豆植物的轉基因事件包括所述轉基因事件。在另一個實施方案 中，本主題公開包括產生所述完整、能育的大豆植物的后代，其中該后代植物包括所述轉基 因事件，并且任選地，包括從所述后代植物產生大豆種子。
[0056] 在該實施方案的另一個方面，本公開提供所述完整、能育大豆植物的包含所述轉 基因事件的后代植物，所述完整、能育大豆植物的后代植物是根據本公開的方法產生的。在 該實施方案的一個進一步的方面，本公開設及從所述后代植物產生的大豆種子，其中所述 大豆種子包含所述轉基因事件。在該實施方案的下一個方面，本公開設及通過將所述完整、 能育轉基因大豆植物與另一大豆植物雜交來產生大豆植物。在該實施方案的一個進一步的 方面，本公開設及通過從所述完整、能育植物與另一大豆植物的雜交收集后代種子，其中所 述后代種子包含所述轉基因事件，來產生后代植物。在該實施方案的另一個方面，本公開設 及通過播種所述后代種子來產生后代植物。在該實施方案的下一個方面，本公開設及通過 從所述后代種子種植后代植物，其中后代植物包含所述轉基因事件，來產生后代植物。在該 實施方案的一個進一步的方面，本公開設及通過從較早世代的后代植物產生后續的、較晚 世代的后代植物，使得該后續的后代植物包含所述轉基因事件，來產生較晚世代的后代植 物。