用于遞送治療性寡核苷酸的雙鏈劑的制作方法
【技術領域】
[0001] 本申請設及可用于遞送治療性寡核巧酸到諸如生物樣品內或患者體內的細胞的 雙鏈核酸劑。治療性寡核巧酸可W包括反義寡核巧酸、antagomir、剪接轉換寡核巧酸、單鏈 siRNA、微小RNA、前體微小RNA及相似物。所述治療性寡核巧酸是雙鏈劑的一條鏈的組成部 分，并通過酶的作用或通過雙鏈結構的解旋至少部分被釋放。該治療性寡核巧酸可被用于 此類寡核巧酸已知的任何目的，其包括，例如，修飾細胞內RNA轉錄水平或蛋白水平。
【背景技術】
[0002] 近年來，寡核巧酸成為正在開發中的被稱為核酸藥的藥物產品的感興趣的主題， 且尤其是從對祀基因的高選擇性和低毒性的角度，對利用反義方法的核酸藥的開發正在積 極進行中。反義方法包括通過將與祀基因的mRNA的部分序列（有義鏈）互補的寡核巧酸 (例如，反義寡核巧酸，或AS0)引入細胞來選擇性地修飾或抑制由祀基因編碼的蛋白的表 達的方法。相似地，反義方法還祀向miRNA并起作用W修飾此類miRNA的活性。 陽00引如圖1中所闡述的（上部），當將包含RNA的寡核巧酸作為AS0引入細胞時，AS0 結合到祀基因的轉錄產物（mRNA)，并且形成部分雙鏈。已知運種雙鏈作為防止核糖體翻譯 的掩蔽物發揮作用，并因此抑制由祀基因編碼的蛋白的表達。
[0004] 另一方面，當將包含DNA的寡核巧酸作為AS0引入細胞時，形成部分DNA-RNA異源 雙鏈體。因為運個結構被RNA酶Η識別且祀基因的mRNA因此被分解，由祀基因編碼的蛋白 的表達被抑制。（圖1，下部）。在許多情況下，與使用RNAAS0的情況比較，當使用DNA作 為AS0 (RNA酶Η依賴途徑）時，基因表達抑制效應更高。
[0005] 當利用寡核巧酸作為核酸藥時，多種核酸類似物，諸如鎖定核酸（LNA)(注冊商 標）、其他橋接核酸度ΝΑ)及相似物已經被開發W提高體內對祀RNA的結合親和力和穩定 性。
[0006] 如圖2中所闡述的，由于天然核酸（RNA或DNA)的糖部分有具有四個碳原子和 一個氧原子的五元環，該糖部分具有兩種構象，Ν型和S型。已知運些構象從一種旋轉為 另一種，并因此，核酸的螺旋結構也采用不同的型，A型和Β型。由于用作之前提到的AS0 祀的mRNA采用呈A型的螺旋結構，糖部分主要呈N型，所W從增加對RNA的親和力的角 度，AS0的糖部分采用N型很重要。已經在該概念下被開發的產品是修飾的核酸，諸如 LNA(2' -0, 4' -C-亞甲基-橋接核酸（2'，4' -BNA))。例如，在LNA中，因為在2'位置上的 氧和在4'位置上的碳通過亞甲基基團橋接，該構象被固定為N型，且構象之間不再存在波 動。因此，與用常規天然核酸合成的寡核巧酸（參見專利文件1)比較，通過滲入幾個LNA 單元合成的寡核巧酸具有對RNA的非常高親和力和非常高的序列特異性，并且還顯示極佳 的熱耐受性和核酸酶耐受性。由于其他人工核酸也具有此類特征，與反義方法和相似方法 的利用相關的人工核酸已備受關注（參見專利文件1到9)。
[0007] 盡管如此，即使使用運些高性能的修飾的核酸設計的反義寡核巧酸仍然缺乏作為 治療劑使用的適合的效率、效力和/或安全性。
[0008] 限制治療性寡核巧酸使用的一個技術問題是不能有效遞送劑到其可引發效力的 位置。對一些類型的治療性寡核巧酸，劑本身的直接遞送可到達活性位置，但通常需要大 劑量且大劑量會損害安全性。低效率遞送的原因可包括代謝的不穩定性、低效率的運輸和 隔絕劑的非特異性的捕獲或結合的相互作用。其他類型，諸如短干擾RNA雙鏈體（siRNA)， 需要復雜的脂質制劑用于遞送，但運些被報道為是昂貴、難W制備并且具有某些毒副作用 (非專利文件1)。因此，存在對將寡核巧酸治療物遞送至生物樣品或患者中的細胞和組織 的更有效方法的公認的需要。
[0009] 此外，當使用反義寡核巧酸作為藥物時，對于一些應用，相關寡核巧酸可高特 異性和高效率遞送到祀位置也很重要。用于遞送寡核巧酸的方法包括使用脂質，諸如膽固 醇和維生素E(非專利文件2和3)，使用受體特異性膚，諸如RVG-9R(非專利文件4)，或使 用對祀位置特異的抗體（非專利文件5)。
[0010] 引用列表
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[0027] 發明概述 陽0測技術問題
[0029] 本發明的目的是提供可遞送治療性寡核巧酸的雙鏈核酸劑。
[0030] 問題的解決方案
[0031] 提供了可遞送治療性寡核巧酸的雙鏈核酸劑，所述雙鏈核酸劑包含第一鏈和第二 鏈，其中所述治療性寡核巧酸是所述第一鏈的一部分。治療性寡核巧酸通常是單鏈劑，但本 身可W是雙鏈或發卡結構。在一些實施方案中，治療性寡核巧酸被設計為引發反義效應。例 如，反義效應可針對蛋白編碼的或非蛋白編碼的轉錄產物。雙鏈核酸劑可因此被應用于改 變祀向的轉錄產物的濃度或活性水平。在一些實施方案中，可使用該劑治療、預防或改善W 具有異常水平轉錄產物為特征的患者中的疾病或狀況。
[0032] 如圖中3A和3B所示，第一鏈包含治療性寡核巧酸區和第一互補區。第一互補區 與第二鏈的一部分或全部互補。第二鏈包含第二互補區。第二互補區與第一互補區的一部 分或全部互補，并任選地可與治療區的一部分互補。然而，不要求第一互補區與第二互補區 完全互補或具有和第二互補區相同的堿基數目。
[0033] 治療性寡核巧酸區可如圖3A和3B中所示與第一鏈的互補區的3'末端，或如圖5 中所示與第一鏈的互補區的5'末端連接。優選地，治療性寡核巧酸可W被連接到第一鏈的 互補區的5'末端。
[0034] 在一些實施方案中，如圖3B中所示，雙鏈核酸劑還包含功能部分。功能部分（X) 可W是檢測標記、遞送或祀向分子或純化標簽。來自一個或更多個運樣類別的一個或更多 個此類部分可被連接到雙鏈核酸劑。在一些實施方案中，此類部分被連接在核酸鏈3'或5' 末端的末端位置。在其他實施方案中，部分可W被連接在中間位置。部分還可通過可斷裂 的接頭連接到鏈。在一些實施方案中，一個或更多個功能部分增強雙鏈核酸劑到祀位置的 高特異性和高效率的遞送。
[0035] 第二鏈可包含一種類型的核巧酸或核巧酸類似物（統稱為"堿基"），或它可 包含兩種或更多種類型的堿基。當包含兩種或更多種類型時，堿基可WWgapmer或 mixmer結構排列。例如，作為gapmer，如通過引用W其整體并入本文的名稱為"化imeric Double-StrandedNucleicAcid"的PCT/JP2012/083180 中關于反義鏈描述的，第二鏈可 W被布置為具有由至少4個連續的DNA核巧酸組成的中屯、區、包含位于中屯、區的5'末端 側的至少2個核巧酸類似物的第一 5'翼區、和包含位于區的3'末端側的至少2個核巧酸 類似物的第一 3'翼區。例如，作為mixmer，第二鏈可W被布置為不具有由4個或更多個連 續DNA核巧酸組成的區。該鏈還可包含W雙翼結構排列的核巧酸或核巧酸類似物，諸如在 共同待審和共同擁有的美國臨時申請號61/771, 115,名稱為"ChimericSingle-Stranded Antisense化lynucleotides"和美國臨時申請號 61/806, 887,名稱為"Double-Stranded AntisenseAgents"的文件中所公開的，其通過引用W其整體并入本文。例如，作為雙翼結 構，第二鏈可W被布置為包含：
[0036] 中屯、核巧酸區，其包含至少4個DNA核巧酸；
[0037] 第一 5'翼區，其連接到中屯、核巧酸區的5'末端，包含1-10個核巧酸，其中至少1 個是核巧酸類似物；
[0038] 第一 3'翼區，其連接到中屯、核巧酸區的3'末端，包含1-10個核巧酸，其中至少1 個是核巧酸類似物；及
[0039] 第二5'翼區和/或第二3'翼區，其中：
[0040] 第二5'翼區被連接到第一 5'翼區的5'末端，具有比天然DNA或RNA更高的對 DNA酶或RNA酶的耐受性，且當遞送完嵌合多核巧酸后在細胞內消失；及
[0041] 第二3'翼區被連接到第一 3'翼區的3'末端，具有比天然DNA或RNA更高的對 DNA酶或RNA酶的耐受性。第二鏈還可W全部或部分地包含膚核酸（PNA)單元。第二鏈可 W自身是反義寡核巧酸。
[0042] 通常，第二鏈被設計為當放入生物樣品（細胞、組織、動物、人等）中時對核酸酶降 解耐受，或更通常，對代謝降解耐受。
[0043] 第一鏈可包含一種類型的核巧酸或核巧酸類似物（統稱為"堿基"），或它可包含 兩種或更多種類型的堿基。如注明的，第一鏈包含第一互補區和治療性寡核巧酸區。僅為 了提及鏈的每個部分的便捷方式命名運些區。一些單獨的核巧酸和/或核巧酸類似物可w是兩個區的一部分。因此，區可"重疊"，其中特定堿基既與第二鏈中的堿基互補且也是治 療性寡核巧酸的一部分。例如，如圖4A-4F中所闡述的，治療性寡核巧酸可不具有與第二鏈 的重疊（圖4A)，或治療性寡核巧酸區可與第二鏈中的一些或甚至多于一半堿基配對（圖 4B-4 巧。
[0044] 僅考慮第一鏈的第一互補區，當包含兩種或更多種類型的核巧酸或核巧酸類似 物時，堿基可WWgapmer或mixmer結構排列。例如，作為gapmer，如名稱為"化imeriC Double-StrandedNucleicAcid"的PCT/JP2012/083180 中關于反義鏈描述的，第一互補區 可被布置為具有包含至少4個連續的RNA核巧酸的中屯、區、第一 5'翼區和第一 3'翼區。
[0045] 僅考慮第一鏈的治療性寡核巧酸區，該區可包含任何類型的核酸治療劑。具體實 例包括反義寡核巧酸、antagomir寡核巧酸、剪接轉換寡核巧酸、單鏈siRNA寡核巧酸、雙鏈 siRNA寡核巧酸、微小RNA、前體微小RNA和適配體（aptamer)。運些劑可用本領域技術人員 已知的任何結構和設計來制備。例如，特定核巧酸或核巧酸類似物可被滲入結構，或可應用 不同類型的堿基在gapmeiNmixmer、單翼或雙翼排列中的排列。
[0046] 在一些實施方案中，第一互補區被設計為當放入生物樣品（細胞、組織、動物、人 等）中時對核酸酶降解耐受，或更通常地，對代謝降解耐受。例如，第一互補區可包含比天 然堿基對核酸酶切割更耐受的堿基（修飾的核巧酸或核巧酸類似物），或它可包含PNA。當 第一互補區被設計為對核酸酶降解耐受時，該區將通常保留與本文公開的方法中的治療性 寡核巧酸的連接。在運種情況，當提及治療性寡核巧酸的釋放時，可恰當理解為意指第一鏈 的釋放（治療性寡核巧酸被連接到第一互補區）。
[0047] 在其他實施方案中，第一互補區被設計為當第一鏈與第二鏈雜交時易被RNA酶Η切割。因此，第一互補區和第二互補區的至少一部分被設計為當兩鏈退火為雙鏈體時被RNA 酶Η識別。通常，為此目的，第一鏈包含RNA核巧酸且第二鏈包含DNA核巧酸W形成異源雙 鏈體。在一些實施方案中，第一互補區包含2個、3個、4個或5個或更多個連續的天然RNA 堿基，任選地其可在一側或兩側的側翼為被修飾的RNA核巧酸。與此類第一互補區互補的 第二互補區的部分可包含天然DNA、修飾的DNA、DNA類似物或促進異源雙鏈體結構的識別 和第一鏈的切割的其他此類堿基。 W48] 在一些實施方案中，治療性寡核巧酸區被設計為當放入生物樣品（細胞、組織、動 物、人等）中時對核酸酶降解耐受，或更通常地，對代謝降解耐受。例如，治療性寡核巧酸區 可包含比天然堿基對核酸酶切割更耐受的堿基（修飾的核巧酸或核巧酸類似物），或它可 包含ΡΝΑ。尤其是，治療性寡核巧酸區通常被設計為在該區的3'和5'末端部分具有比天然 堿基對于切割或降解更為耐受的至少1個、2個、3個或至少4個堿基。如W上指出的，在末 端部分之一的運些堿基中的一些還可W是第一互補區的一部分。
[0049] 當第一互補區包含易被諸如RNA酶Η切割或降解的一些堿基，且切割反應發生時， 包含治療性寡核巧酸區的第一鏈的部分可仍還包含第一互補區的一部分。是第一互補區的 一部分的運些堿基中的一些可容易被進一步的切割或降解。例如，此類堿基可經歷外切核 酸酶切割。即使在樣品環境中可存在此類堿基，它們可被除去，但預計在治療性核巧酸區的 末端部分比天然堿基對切割或降解更耐受的堿基的存在防止諸如通過外切核酸酶的進一 步作用對治療性寡核巧酸的切割或降解。
[0050] 在仍其他實施方案中，可包括在任一第一或第二鏈的5'末端、3'末端或兩個末端 上和/或在治療性寡核巧酸區的任一個或兩個末端上添加的另外的核巧酸或類似物，其顯 示核酸酶耐受性和對于蛋白和蛋白樣細胞組分低的結合親和力。
[0051] 本發明人已確定了，當雙鏈核酸劑被引入細胞時，雙鏈核酸劑可釋放治療性寡核 巧酸，然后治療性寡核巧酸可W起作用W例如修飾轉錄產物的活性或功能。轉錄產物可W 是蛋白編碼轉錄產物或非蛋白編碼產物諸如miRNA。本申請還設計了通過反義效應改變細 胞中蛋白的表達水平和改變蛋白結構的方法。
[0052] 雙鏈核酸劑還可用于治療具有W改變的基因表達水平使得例如蛋白過表達為特 征的狀況的患者。通過用包含雙鏈核酸劑的藥物組合物治療患者，基因表達水平可被特異 地阻抑或抑制到蛋白水平下降的程度，由此減輕狀況。
[0053] 在某些實施方案中，W下被提供。
[0054] (1) 一種遞送治療性寡核巧酸到細胞的方法，所述方法包括： 陽化5] 使組合物與所述細胞接觸，所述組合物包含：
[0056] 雙鏈核酸劑，所述雙鏈核酸劑包含退火到第二核酸鏈的第一核酸鏈，
[0057] 其中：
[0058] 所述第一核酸鏈包含（i)第一RNA區，所述第一RNA區具有當所述第一核酸鏈與 所述第二核酸鏈雜交時可被RNA酶Η識別的至少2個連續的RNA核巧酸，（ii)治療性寡核 巧酸區，其中在所述治療性寡核巧酸區的3'和5'末端的至少一個核巧酸間鍵比天然核巧 酸間鍵更耐受核酸酶，