Charcot-Marie-Tooth病的治療劑的篩選方法以及為此所使用的自分化運動神經元的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及制備誘導多能干細胞的方法W及使用由所述誘導多能干細胞分化而 來的自體細胞篩選化arcot-Marie-Tooth病的治療劑的方法。
【背景技術】
[0002] Qiarcot-Marie-Tooth病（CMT)或遺傳性運動感覺神經病變化ereditarymotor andsenscxryneuropathy)是由特定基因突變引起的運動神經元和感覺神經元的缺陷或損 壞。遺傳性周圍神經病變可分為Ξ組，即，遺傳性運動感覺神經病變（HMSN)、遺傳性運動神 經病變（HMN)和遺傳性感覺神經病變化SN)。因此，遺傳性運動感覺神經病變是其中之一。 由于該病是在1886年由化a;rcot、Ma;rie和Tooth首次發現的，所W將該病用他們的名字命 名（即，化arcot-Marie-Tooth病），或者用他們名字的首字母簡單地稱為CMT。在20世紀 后期，Dyck等將CMT叫做另一個名字遺傳性運動感覺神經病變0MSN)"，此后該病如今被 叫做CMT或歷SN。根據遺傳模式，化arcot-Marie-Tooth病被分為許多組，即常染色體顯性 遺傳的I型和II型、常染色體隱性遺傳的IV型和X染色體連鎖遺傳的CMTX型。根據基因 突變的報道順序，將I型成員命名為1A、1B、1C等。
[0003] 化arcot-Marie-Tooth病的發病率是1/2500,運在罕見遺傳性疾病中相當高。 化arcot-Marie-Tooth病患者表現出此類癥狀：他們手/腳的肌肉變得越來越無力，而且他 們的手和腳經常是變形的。癥狀的程度根據基因突變的類型而改變。一些患者表現為幾乎 接近正常人的輕度癥狀，一些患者顯示出嚴重癥狀，W致于他們需要行走方面的幫助或者 要坐輪椅。
[0004]CMT的傳統治療方法限于康復、輔助技術設備和疼痛控制。但是，CMT相關基因的 鑒定使得遺傳咨詢和家庭計劃成為可能，在此基礎上，W科學為基礎的臨床護理正在推進 中。尚未建立可改變遺傳性運動感覺神經病變的進展過程的實際治療或幫助，但最近的動 物測試確證了運一可能性。同時，仍在進行關于如下的研究：基因療法、細胞替代療法、軸突 運輸相關療法、線粒體功能矯正、基于免疫系統的療法和整合素療法。
[0005] 隨著過去幾十年在罕見疾病研究中的驚人進步，在該疾病的治療（從診斷到治 療，包括實踐指南）方面取得了量和質的變化。特別是，分子生物學的進步使得診斷方法發 生變化，并因此建立了由個體化代表的祀向療法或考慮到罕見疾病的不同分子生物學起源 的定制療法（tailoredtherapy)。另外，遺傳藥理學的發展提供了如下構想：考慮患者自 身的遺傳特征，可區別對待甚至具有相同疾病或服用相同藥物的患者。因此，我們可將現在 稱為"分子遺傳學的時代"。特別是，就各種治療選擇和預后（包括旨在用藥物療法和額外 治療減輕癥狀的癥狀性治療，W及旨在減輕和控制副作用與并發癥的支持性療法）而言， 在罕見疾病中CMT是公開最多的。CMT由基因功能障礙引起，所W癥狀是持續的并且不能完 全治愈。因此，CMT的常規治療在于減輕癥狀和延遲進展，W提高生活質量。已通過遺傳和 分子生物學研究不斷地嘗試生物學治療，并報道了一些有前途的結果。然而，該疾病的特征 導致發病罕見，并且推進該研究的興趣也低，因此合適的治療方法尚未建立，并且，能夠診 斷并設計用于此類罕見疾病的治療的醫生和研究人員仍短缺（ActaPaediat;ri，2012)。
[0006] 根據W前的報道，在給予孕酬受體括抗劑"奧那司酬（onapristone)"(已知的一 種CMT治療藥物）的轉基因小鼠中，Pmp22mRNA的過表達被抑制，遺傳性運動感覺神經病 變的表型得到改善，也沒有副作用。抗壞血酸（對外周神經的髓銷形成（myelination)而 言至關重要的物質）在髓銷再生（remyelination)中起作用，并改善了CMT1A轉基因小鼠 中遺傳性運動感覺神經病變的表型。還報道了神經營養蛋白-3 (NT-3)使有髓神經纖維增 加，由此使感覺相關的癥狀得到改善。然而，上述治療物質限于1型CMT治療。CMT由幾十 種不同的基因突變引起。因此，為了治療具有多樣性的此類CMT，迫切需要建立各基因缺陷 的定制治療方法W及評估新建立的治療方法的方法。在CMT患者中，對藥物的應答大大不 同，因此藥物選擇由于CMT患者的癥狀均不同而受到限制。
[0007] 獲得自患者皮膚組織的干細胞具有該患者的基因突變的特征。因此，當所述干細 胞分化為神經元時，可獲得具有該患者所有疾病特征的神經元，預計運對藥物選擇或患者 特異性治療有用。
[0008] 化arcot-Marie-Tooth病（CMT)(代表性遺傳性周圍神經病變）是單基因素亂。可 通過源自患者皮膚細胞的誘導多能干細胞的分化來構建CMT疾病模型。可通過使用能夠重 現該疾病特征的此類疾病模型來制備新的治療劑。將源自患有脊髓性肌萎縮、家族性自主 神經機能異常（dysautonomia)或LEOPARD綜合征的患者的誘導多能干細胞用于在體外重 現運些患者的異常和癥狀。當用測試藥物處理培養的細胞時，癥狀得到改善巧bedAD.等， Nature,2009,457 :277-280;LeeG.等，Nature,2009,461:402-406 ;Cavajal-Vergara X.等，化 1:ure，2010,465 :808-812 ;化nnaJ.等，Science, 2007, 318:1920-1923)。因此，誘 導多能干細胞和由該誘導多能干細胞分化而來的自體細胞可用于該途徑，W給患有沒有合 適的治愈手段（cure)的運些疾病的患者開發出患者特異性的新藥物，運表明它們可對患 有不可治愈的罕見疾病的患者有幫助。
[0009] 在建立用于化arcot-Marie-Tooth病（CMT)患者的患者特異性治療方法的研究過 程中，本發明人首次從源自CMT患者的人成纖維細胞制備出誘導多能干細胞。然后，本發明 人進一步確認了，使用由所述誘導多能干細胞分化而來的運動神經元進行的CMT治療劑候 選物的篩選方法可對該候選物的藥學效果的確認有用；并且，本發明人進一步通過本發明 的方法構建出自體運動神經元，該自體運動神經元可用于患者特異性藥物的篩選，并因此 可用于患者特異性治療，從而完成了本發明。
【發明內容】
[0010] 技術問題
[0011] 本發明的一個目的是提供用于從體細胞制備運動神經元的方法，所述體細胞來源 于Qiarcot-Marie-Tooth病（CMT)患者。
[0012] 本發明的另一目的是提供CMT治療劑候選物的篩選方法。
[0013] 本發明的再一目的是提供由通過本發明的方法制備得到的誘導多能干細胞分化 而來的CMT患者自體運動神經元。
[0014] 本發明的又一目的是提供使用通過本發明的方法制備得到的CMT患者自體運 動神經元進行的患者特異性CMT類型依賴性治療劑（CMTtype(kpendenttherapeutic agent)的篩選方法。
[001引技術方案
[0016] 為了實現上述目的，本發明提供了用于從體細胞制備運動神經元的方法，所述體 細胞來源于Oiarcot-Marie-Tooth病（CMT)患者。
[0017] 本發明還提供了CMT治療劑候選物的篩選方法。
[0018] 本發明進一步提供了由通過本發明的方法制備得到的誘導多能干細胞分化而來 的CMT患者自體運動神經元。
[0019] 另外，本發明提供了使用通過本發明的方法制備得到的CMT患者自體運動神經元 進行的患者特異性CMT類型依賴性治療劑的篩選方法。
[0020] 有益效果
[0021] 本發明提供了用于從人成纖維細胞制備誘導多能干細胞的方法，所述人成纖維細 胞來源于化arcot-Marie-Tooth病（CMT)患者；通過使用由所述誘導多能干細胞分化而來 的運動神經元進行的CMT治療劑候選物的篩選方法，該方法可有效確認運些候選物的藥學 效果；W及通過用于制備誘導多能干細胞的方法制備的CMT患者自體運動神經元。可將所 述自體運動神經元有效用于患者特異性藥物的篩選W及患者特異性治療。
【附圖說明】
[0022] 參考附圖來更好地理解本發明的優選實施方式的應用，其中：
[0023] 圖1為說明本發明中使用的人成纖維細胞的形狀的圖。
[0024] 圖2為說明從源自CMT的誘導多能干細胞（iPSC)分化出運動神經元的方法的圖。
[00幼 圖3為說明源自CMT的誘導多能干細胞（CMT2F-iPSC)中服P27 (致CMT基因） 的基因突變的圖。
[0026] 圖4為說明CMT2F-iPSC集落的形狀的圖。從培養開始起20天拍攝運張照片，細 胞密集聚集在誘導多能干細胞集落中。
[0027] 圖5為說明CMT2F-iPSC內源多能性基因的表達的圖。
[0028] 圖6為說明CMT2F-iPSC干性（ste皿ess)標志物蛋白的表達的圖。
[0029]圖7為說明由CMT2F-iPSC誘導而來的胚狀體巧B)的體外分化潛能的圖，其中， 確認了外胚層標志物巢蛋白、中胚層標志物平滑肌肌動蛋白（SMA)和內胚層標志物甲胎蛋 白（AFP)的表達。
[0030] 圖8為說明通過觀測體內CMT2F-iPSC崎胎瘤形成所確證的分化潛能的圖。
[0031] 圖9為說明由CMT2F患者分化而來的CMT2F-MN的標志物蛋白的表達W及神經 肌肉接頭（neuromus州larjunction)形成的一組圖；
[0032] 圖9a為說明CMT2F-MN標志物蛋白化B9、I化1、SMI32、Tujl、MAP2突觸蛋白和 ChA