新型o-磷酸絲氨酸輸出蛋白及使用其生產o-磷酸絲氨酸的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種新型分離的多膚，所述多膚具有輸出0-憐酸絲氨酸（在下文中描 述為"OPS")的能力，所述OPS是k半脫氨酸的前體；編碼該多膚的多核巧酸；包含該多核 巧酸的載體；生產OPS的微生物，所述微生物具有增強的多膚活性；使用該微生物生產OPS 的方法；W及制備半脫氨酸或其衍生物的方法，所述方法包括在0-憐酸絲氨酸硫化氨解酶 ((PS巧或表達0PSS的微生物的存在下，使由上述生產(PS的方法生產的(PS與硫化物進行 反應。
【背景技術】
[0002] 心半脫氨酸一-在所有活的有機體中的硫的代謝作用中起重要作用的氨基 酸一-不僅用于生物蛋白質諸如毛發角蛋白、谷脫甘膚、生物素、甲硫氨酸及其它含硫代謝 物的合成，也用作輔酶A生物合成的前體。
[0003] 利用微生物生產k半脫氨酸的已知方法包括利用微生物將化L-ATC生物轉化 為k半脫氨酸的方法（Ryu0H等人，ProcessBiochem. , 32:201-209, 1997)。另一個已知 的方法是通過使用大腸桿菌直接發酵生產k半脫氨酸的方法巧P0885962B;WadaΜand TakagiΗ,Appl.Microbiol.Biochem. , 73:48-54, 2006)。同時，本發明人進行研究W開發新 的生產心半脫氨酸的方法，結果發現在某些微生物中從0-憐酸絲氨酸（OP巧合成k半脫 氨酸的酶（0-憐酸絲氨酸硫化氨解酶（0PSS))。基于該發現，本發明人開發了通過將(PS與 0PSS酶反應、通過培養突變微生物W在其中積累(PS而生產半脫氨酸的方法（韓國專利公 開號10-2012-004111)。為了W高產量生產半脫氨酸，仍需要生產過量的OPS。因此，本發 明人已做出大量的努力W發現合適的輸出物（exporter),所述輸出物使在生產OPS的菌株 中生產的0-憐酸絲氨酸能被順利地從細胞釋放。此外，基于不同類型的已知轉運蛋白，本 發明人篩選出編碼0-乙酷絲氨酸/半脫氨酸外排累蛋白（effluxpumpprotein)的ydeD、 編碼0-乙酷絲氨酸/半脫氨酸外排通透酶的鐘化(hankeI,ReschA,DasslerΤ,Maier ΤandBockA,J.Bacteriology, 185:1161-166, 2003)、編碼高絲氨酸 / 高絲氨酸內醋外排 累蛋白的rh1:B狂akataevaNP,AleshinVV,TokmakovaIL,T;roshinPV,LivshitsVA陽BS Lett1999 ;452 (3) :228-32)等，并具體發現生產OPS的菌株中化巧的增強導致OPS的濃 度增加（韓國專利公開號10-2012-0041115)。然而，對于半脫氨酸更高產量的生產，仍需要 開發具有更高輸出(PS能力的轉運蛋白。
【發明內容】
[0004] 技術問題
[0005] 本發明人已做出大量的努力發現具有(PS輸出活性的蛋白質，W能夠進一步增加 OPS的生產，結果是，已鑒定出兩種具有優異(PS輸出活性的新型多膚，并發現該多膚可W 更有效地從生產OPS的菌株中輸出0PS，從而完成本發明。
[000引解決方案
[0007] 本發明的一個目的是提供生產0-憐酸絲氨酸（0P巧的方法，其包括培養生產 0-憐酸絲氨酸的微生物，所述微生物具有增強的多膚活性，所述多膚具有SEQIDN0:1或2 的氨基酸序列，并且具有WS輸出活性。
[0008] 本發明的另一個目的是提供一種新型分離的多膚，其具有SEQIDN0:1或2的氨 基酸序列，并且具有0-憐酸絲氨酸輸出活性。
[0009] 本發明的又一個目的是提供編碼該多膚的多核巧酸，W及包含該多核巧酸的載 體。
[0010] 本發明的又一個目的是提供一種具有增強的多膚活性的生產0-憐酸絲氨酸的微 生物，所述多膚具有SEQIDNO: 1或2的氨基酸序列，并且具有0-憐酸絲氨酸（0P巧輸出 活性。
[0011] 本發明的又一個目的是提供生產半脫氨酸或其衍生物的方法，其包括在0-憐酸 絲氨酸硫化氨解酶（CPS巧或表達0PSS的微生物的存在下，使由上述生產0-憐酸絲氨酸的 方法所生產的0-憐酸絲氨酸與硫化物進行反應。
[0012] 發明的有利效果
[0013] 本發明的具有SEQIDNO: 1或2的氨基酸序列的新型多膚具有優異的(PS輸出活 性，因而將該多膚應用于生產0-憐酸絲氨酸的微生物時，在該微生物中可W高效率地生產 0-憐酸絲氨酸。
[0014] 附圖簡述
[001引圖1是顯示在將OPS完全移除后通過高效液相色譜她LC)測量細胞內OPS的結 果的圖解圖，所述WS是從本發明的具有增強的Yg巧蛋白和MacB蛋白活性的重組微生物 的培養物中釋放。
[0016] 圖2是顯示通過從0-憐酸絲氨酸的生物合成和微生物發酵積累0-憐酸絲氨酸并 將所積累的0-憐酸絲氨酸酶促地轉化成k半脫氨酸而生產k半脫氨酸的方法的示意圖。
[0017] 實施發明的最佳方式
[0018] 本發明的方面包括生產0-憐酸絲氨酸（0P巧的方法，其包括培養具有增強的多膚 活性的生產0-憐酸絲氨酸的微生物，所述多膚具有SEQIDN0:1或2的氨基酸序列，并且 具有0-憐酸絲氨酸（0P巧輸出活性。
[0019] 具體地，根據本發明的W上方面所述的方法可W包括W下步驟：a)通過培養具有 增強的多膚活性的生產WS的微生物來生產0PS，所述多膚具有SEQIDNO: 1或2的氨基酸 序列，并且具有(PS輸出活性；和b)從微生物的培養物中分離0PS，但不限于此。
[0020] 本發明方法的步驟a)是培養具有增強的多膚活性的生產(PS的微生物的步驟，所 述多膚具有SEQIDNO: 1或2的氨基酸序列，并且具有(PS輸出活性。
[0021] 如本文所使用的，術語"0-憐酸絲氨酸（在下文中描述為"OPS")"是指絲氨酸和 憐酸的醋，其是許多蛋白質的組分。WS是k半脫氨酸的前體，并且可W在WS硫化氨解酶 (在下文中描述為"0PSS")的催化作用下通過與硫化物反應而轉化成半脫氨酸。因此，其 是半脫氨酸的生產中提高WS生產率的重要因素，并因此需要開發出使細胞內WS能夠從 生產OPS的菌株中有效分泌的轉運蛋白。
[0022] 如本文所使用的，表述"具有0-憐酸絲氨酸（0P巧輸出活性的多膚"是指具有OPS 輸出活性的膜蛋白。具體地，該多膚是大腸桿菌巧.coli)膜蛋白。本發明人已鑒定出兩種 大腸桿菌膜蛋白，該膜蛋白是能夠將WS從細胞中輸出并且衍生自可W在過量WS存在的 條件下生長的大腸桿菌的新型膜蛋白。具體地，具有WS輸出能力的新型大腸桿菌膜蛋白 是具有SEQIDNO: 1的氨基酸序列的、經鑒定的Yg巧一一其為預測的內膜蛋白一一和具有 沈QIDN0:2的氨基酸序列的、經鑒定的MacB(MacAB-TolC大環內醋輸出轉運系統-膜亞 單元）。已知的是，SEQIDN0:1的Yg巧蛋白充當大腸桿菌內膜蛋白，而SEQIDN0:2的 MacB蛋白充當大環內醋轉運蛋白，但在本發明之前該蛋白的OPS輸出活性并非是已知的， 并且是由本發明人首次鑒定。此外，本發明多膚的范圍不僅涵蓋具有SEQIDN0:1或2的 氨基酸序列的多膚，而且涵蓋具有與SEQIDN0:1或2的氨基酸序列具有至少70%、具體地 至少80%、更具體地至少90%、甚至更具體地至少95%、甚至更具體地至少98%W及最具 體地至少99%同源性的氨基酸序列，并且基本上具有與SEQIDN0:1或2的多膚相同或相 當的WS輸出活性的膜蛋白。此外，明顯的是，只要具有上述同源性且基本上具有WS輸出 活性，包含SEQIDNO: 1或2的氨基酸序列的一個或多個氨基酸殘基的缺失、修飾、取代或 添加的多膚變體都落在本發明的范圍內。
[0023] 如本文所使用的，術語"同源性"是指兩個多核巧酸或多膚部分之間的同一性的百 分比。從一種形式至另一種形式的序列間的對應關系可W通過本領域已知的技術確定。例 如，同源性可W通過對兩個多膚分子之間的序列信息進行直接比較而測定，所述比較通過 比對序列信息并使用容易獲得的計算機程序進行。可選地，同源性可W通過如下測定：在同 源區域之間形成穩定雙鏈體的條件下多核巧酸的雜交，然后用單鏈特異性核酸酶的消化W 及消化片段的尺寸測定。
[0024] 如本文所使用的，所有語法形式和拼寫變型的術語"同源的"是指蛋白之間的關 系，所述蛋白具有"共同的進化起源"，包括來自超家族的蛋白質化及不同物種的同源蛋白。 運種蛋白（及其編碼基因）具有由其高程度的序列相似性反映的序列同源性。然而，在通 常使用和本發明中，當用形容詞如"非常高"修飾時，術語"同源的"可W是指序列相似性， 而不是共同的進化起源。
[0025] 如本文所使用的，術語"序列相似性"是指可W或可W不共享共同的進化起源的 蛋白質的核酸或氨基酸序列之間的同一性或對應關系的程度。在一個實施方式中，當多膚 的至少約21% (具體地至少約50%，并且最具體地至少約75%、90%、95%、96%、97%或 99% )在氨基酸序列的限定長度上匹配時，兩個氨基酸序列是"基本上同源的"或"基本上 相似的"。基本上同源的序列可W通過使用序列數據庫中可用的標準軟件來比較序列而鑒 定，或者例如在針對該具體系統所限定的嚴格條件下通過DNA雜交實驗進行鑒定。限定適 當的雜交條件是在本領域的技術范圍內（例如，參見Sambrook等人，1989,in化a)。
[0026] 在本發明的實施例中，顯示出，相比作為比較組的具有增強的rhtB、emrD或ycaD 的菌株（實施例3)，具有SEQIDN0:1的氨基酸序列的多膚的增強活性或具有SEQIDN0:2 的氨基酸序列的多膚的增強活性的菌株具有優異的(PS分泌活性。
[0027] 如上所述，本發明的多膚具有優異的(PS輸出活性，并因此當培養具有增強的多 膚活性的微生物時，可W有效生產OPS。
[0028] 只要是可W增強多膚的活性，增強多膚活性的方法并不受具體地限制。該方法的 實例包括增加編碼多膚的基因的細胞內復制數目的方法、將突變引入編碼多膚的染色體基 因的表達調控序列的方法、用具有強活性的序列置換編碼多膚的染色體基因的表達調控序 列的方法、用經突變W增加多膚活性的基因取代編碼多膚的染色體基因的方法、W及將突