一種新型高靈敏度呼吸道病毒核酸nasba擴增引物及檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫藥學技術領域，尤其涉及一種呼吸道病毒檢測的基因擴增技術，更具體的建立一種高靈敏度的呼吸道病毒核酸NASBA擴增技術。具體包括一對呼吸道病毒特異性擴增引物，NASBA擴增反應體系及NASBA產物檢測體系。
【背景技術】
[0002]急性呼吸道感染是人類致病和死亡的最主要原因之一。引起感染的病原體種類多，包括細菌、病毒、支原體和衣原體等，尤以病毒多見。無論病因如何，呼吸道感染的臨床癥狀和體征都很相似，而不同種類病原體引起的感染，其治療方法截然不同，療效和病程也不盡相同。
[0003]呼吸道病毒作為最主要的致病病原體，種類繁多，需要快速進行鑒別。目前臨床上呼吸道病毒感染的檢測手段主要分為四類:第一類為最經典的病毒培養，是呼吸道病毒感染檢測的金標準；但由于病毒繁殖有嚴格的嗜宿主性，需要根據不同的病毒選擇各自敏感的細胞株，造成操作上的繁瑣；且病毒培養周期長，不能很好的滿足臨床的需求。第二類為免疫學方法，也為目前最常用的方法。根據檢測目標物為抗原/抗體，可分為直接免疫熒光法/間接免疫熒光法或是酶聯免疫吸附實驗。間接免疫熒光法/酶聯免疫吸附實驗雖然檢測方法簡單，但靈敏度低，且受干擾因素較多。直接免疫熒光法主要檢測呼吸道病毒抗原，靈敏度較前兩者高，但樣本多取自病患咽拭子或肺泡灌洗液，增加了病患的痛苦，因此實用性比較低。第三類為核酸擴增技術，該方法包含多種基于病毒核酸的檢測方法如聚合酶鏈式反應(PCR)、NASBA技術、環介導的等溫擴增技術等。由于PCR檢測時間短、靈敏度高，為目前最具有吸引力的方法。但該種方法需要首先將病毒RNA逆轉錄成cDNA，然后再進行特異核酸序列的擴增反應，增加了污染的機會，限制了此類技術在臨床檢測中的廣泛應用。第四類為基因芯片、下一代測序技術及質譜技術等，這些先進的檢測技術雖然大大提高了靈敏度，但耗時長或是價格昂貴，科研用途較多，目前尚未在臨床病原體檢測中得到大規模應用。
[0004]呼吸道病毒中，除少數如腺病毒為DNA病毒外，其余大多數為RNA病毒。目前PCR技術整個過程耗時雖較傳統方法縮短，靈敏度必然有所下降。NASBA技術是直接以RNA為模板的核酸擴增技術，在AMV逆轉錄酶、T7RNA聚合酶及RNaseH酶的作用下，短期內可在恒溫條件下將模板RNA放大至101(]-1012拷貝量。該實驗過程可認為分為非循環相及循環相兩部分:在非循環相，引物1在其5’端人工加上了一段T7RNA聚合酶識別啟動子序列，引物1的3’端則與RNA模板序列互補。在AMV逆轉錄酶的作用下，以病毒RNA為模板合成cDNA鏈；RnaseH識別RNA-DNA雜合雙鏈并水解其中的RNA鏈；引物2與剩下的DNA鏈互補，在AMV逆轉錄酶催化下，以DNA鏈為模板合成互補鏈，形成雙鏈DNA ；T7RNA聚合酶識別啟動子序列，催化合成大量的RNA。新合成的RNA進入循環相，成為新的模板，如此循環往復，使RNA拷貝數迅速擴大。綜上所述，NASBA技術與PCR技術的最大不同之處有三點:1)與PCR技術以DNA為模板不同，NASBA技術直接以RNA為模板，操作具有更簡潔性；2)PCR需要進行變性-復性-延伸過程，至少需要兩個溫度的變化，而NASBA技術為恒溫擴增，因此NASBA技術不需要特殊的設備；3)NASBA技術的靈敏度與PCR相比高1000倍左右，可顯著提高臨床核酸病毒的檢出率，能更好的臨床檢測需要。
[0005]根據NASBA的技術原理，其最終產物為大量與RNA模板學列一致的片段，為使產物片段可視化，之前曾采用瓊脂糖凝膠顯像技術，但由于瓊脂糖凝膠所用染料為溴化乙錠，具有一定的毒性，目前多采用NASBA技術偶聯酶標(熒光)探針雜交的方式進行產物量的檢測。由于呼吸道病毒大多數為單鏈RNA病毒，現有檢測方法引物設計原則多采用與RNA模板相反的單條引物的5’端引入T7RNA聚合酶啟動子區域，最后大量擴增而成的是與病毒RNA模板序列一致的RNA分子，并以此為基礎達到病毒檢測的目的。由此可知，經典NASBA技術偶聯酶標(熒光)探針雜交法僅能識別與模板鏈相一致的RNA序列，且檢測過程中須通過酶標(熒光)探針偶聯的顯色技術，增加了該方法的操作繁瑣性及需要用到顯色設備等。同時，由于呼吸道病毒大多數為RNA病毒，在病人樣本保存過程中極易降解，故進一步提高NASBA技術的檢測靈敏度、降低技術操作繁瑣程度已成為臨床RNA病毒檢測中急待解決的問題。
[0006]一直以來，研究人員致力于開發一種靈敏度更高、操作更簡便、設備要求更簡單的呼吸道病毒核酸檢測方法。經典的NASBA技術僅在引物1的5’端添加一段T7RNA聚合酶啟動子識別序列，以保證能合成與模板序列一致的RNA復制子，方便后續探針進行雜交檢測。
【發明內容】
[0007]有鑒于現有技術的上述缺陷，本發明首先要解決的技術問題是提供新型高靈敏度呼吸道病毒核酸NASBA擴增引物。為實現上述目的，本發明提供如下的技術方案:
[0008]本發明公開了一對針對呼吸道病毒基因的特異性擴增引物，其設計原則為通過查詢NCBI數據庫及利用序列比對軟件，選擇呼吸道病毒保守區域，并在該區域設計擴增引物；其所設計的引物在合成是引物5’端均帶有T7RNA聚合酶識別的啟動子序列，如SEQ所不ο
[0009]本發明所要解決的另一個技術問題是提供一種新型高靈敏度呼吸道病毒核酸NASBA擴增檢測方法，該方法包括以下步驟:
[0010](1)制備權利要求1或2所述的擴增引物，
[0011](2)制備擴增試劑盒，所述擴增試劑盒由以下檢測試劑組成:
[0012]本發明進一步公開了針對呼吸道病毒的NASBA檢測試劑盒，由如下成分組成:
[0013]1)引物
[0014]引物FP:0.25ul
[0015]引物RP:0.25ul
[0016]所述引物序列如SEQ所示。
[0017]2) NASBA 擴增試劑
[0018]BA (緩沖液):2ul
[0019]DA:dNTP0.25ul
[0020]ΝΑ:NTP0.5ul
[0021]DMSO:0.25ul
[0022]EM(酶混合物):AMV 逆轉錄酶，RNAseH, T7RNA 聚合酶，BSA 5.5ul
[0023]3) NASBA產物檢測試劑
[0024]1%瓊脂糖凝膠
[0025]本發明進一步公開了針對呼吸道病毒NASBA檢測試劑盒的使用方法，其特征包括如下步驟:
[0026]1)擴增反應體系:
[0027]lul 待檢樣本 RNA，0.25ul FP，0.25ul RP，2ul ΒΑ,Ο.25ul DA，0.5ul NA，0.25ulDMSO。
[0028]2) NASBA 擴增過程:
[0029]65。加熱 5min，42。降溫 5min 后加入 5.5ul EM, 42° 反應 60min。
[0030]3) NASBA產物檢測過程:
[0031]①稱取0.6g瓊脂糖凝膠，置于100ml錐形瓶中，加入60ml TAE，微波爐加熱至沸，冷卻至70°左右加入GelRed染料，倒入凝膠模塊中，待冷卻凝固；
[0032]②將NASBA擴增產物加入2ul上樣緩沖液終止反應后，分別加入到凝膠上樣孔中；
[0033]③100V進行電泳lOmin，觀察目的條帶有誤，判斷結果。
[0034]本發明更加詳細的制備方法如下(以呼吸道合胞病毒為例):
[0035]1、試劑組成
[0036]1.1 引物
[0037]針對呼吸道合胞病毒的N基因保守區設計合成引物，由上海生物工程有限公司合成，序列如下:
[0038]FP:AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGX ；
[0039]RP:AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGY ；
[0040]前段序列為T7RNA聚合酶識別的啟動子序列“X、Y”代表呼吸道病毒(如呼吸道合胞病毒、Β型流感病毒、副流感病毒1型及副流感病毒3型)的保守序列或互補序列。
[0041 ]1.2NASBA 擴增試劑
[0042]ΒΑ (緩沖液):購自TAKARA公司
[0043]DA: 10mM dNTP，購自生工生物工程(上海)股份有限公司
[0044]NA: 10mM NTP，購自生工生物工程(上海)股份有限公司
[0045]DMS0:購自 S i gma 公司
[0046]EM (酶混合物):10U AMV，0.2 ?0.6U RNAseH, 38 ?63U T7RNA 聚合酶，2.5ug BSA,均購自TAKARA公司
[0047]1.3NASBA產物檢測試劑
[0048]瓊脂糖粉，購自生工生物工程(上海)股份有限公司
[0049]2、NASBA 檢測過程
[0050]2.1擴增體系
[0051]取lul 樣本 RNA 模板、2ul ΒΑ、0.25ul ΝΑ、0.5ul DA、0.25ul DMSO 及 0.25ulFP、
0.25ulRP加入0.2ml PCR擴增管中。
[0052]2.2擴增過程
[0053]將上述PCR擴增管放置擴增儀上65°加熱5min后進入42°降溫5min;隨后加入
5.5ul EM,繼續 42。反應 60min。
[0054]2.3NASBA擴增產物的檢測
[0055]2.3.1稱取0.6g瓊脂糖粉末加入到60ml TAE緩沖液中，微波爐加熱至溶解后加入GelRed染料，倒入凝膠模塊中，插入孔梳。
[0056]2.3.2取2ul上樣緩沖液加入到擴增產物中終止反應。
[0057]2.3.3待上述凝膠凝固后，取下孔梳，在一個加樣孔中加入點泳標準品，其他孔中分別加入擴增產物，100V電壓電泳lOmin。
[0058]2.3.4在電泳顯像儀中觀察目的條帶的有無，判斷結果。
[0059]本發明的有益效果是:本發明通過在與呼吸道病毒RNA序列兩端互補的兩條引物的5’端均添加T7RNA聚合酶啟動子識別序列，使其在進入循環相時能夠合成既與模板序列一致的RNA學列[RNA (+)]，又能合成與模板RNA序列互補的RNA序列[RNA㈠]。如此，在循環相反應中，RNA(+)和RNA(-)可分別作為模板，經過N次循環，RNA擴增效率能得到顯著提高(公式1)，從而大大提高病毒核酸的檢測靈敏度；可直接采用患者咽拭子標本進行擴增，而無需進行逆轉錄過程，節省操作時間；同時，結合近期瓊脂糖凝膠電泳所用燃料已更新換代為無毒性的燃料，故其檢測成本將大幅度降低，消除有毒、有害染料對人體及環境的危害，且操作過程更簡便，雙引物設計增加了引物二聚體及發卡結構更加復雜等問題，在選擇引物時需要注意。
[0060]單側引物+T7 RNA聚合酶啟動子序列設計:
[0061]擴增產物量1=TXAn
[0062]雙側引物+T7 RNA聚合酶啟動子序列設計:
[0063]擴增產物量2= TXAnX2n
[0064]則:通過對雙側引物進行改進后，其產物量增加倍數為:
[0065]P =擴增產物量J擴增產物量1= 2 N
[0066]其中T為原始模板數，A為擴增效率，N為循環數。
[0067]公式1.雙側引物設計擴增效率比較
[0068]通過將該設計應用于NASBA技術，可使檢測方法靈敏度更高、結果更準確、操作更方便。
【附圖說明】
[0069]圖1是本發明的技術原理圖。
[0070]圖2是本發明與PCR方法比對實驗圖。
[0071]圖3是本發明應用于呼吸道合胞病毒引物單側及雙側設計比對圖。
[0072]圖4是本發明應用于呼吸道合胞病毒特異性檢測。
[0073]圖5是本發明應用于B型流感病毒引物單側及雙側設計比對圖。
[0074]圖6是本發明應用于B型流感病毒特異性檢測圖。
[0075]圖7是本發明應用于副流感病毒1型引物單側及雙側設計比對圖。
[0076]圖8是本發明應用于副流感病毒1型特異性檢測圖。
[0077]圖9是本發明應用于