一種快速檢測(cè)凝結(jié)芽孢桿菌的方法及多重pcr試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明設(shè)及一種芽抱桿菌的檢測(cè)技術(shù)，特別是快速檢測(cè)凝結(jié)芽抱桿菌的方法及多 重PCR試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]凝結(jié)芽抱桿菌度acillus coagulans)為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體呈桿狀，芽抱端生，可 發(fā)酵糖類產(chǎn)生k乳酸，所W又被稱為"有抱子性乳酸菌"。由于菌株自身的安全性、有效性、 經(jīng)濟(jì)性和環(huán)境友好性，成為我國(guó)農(nóng)業(yè)部《飼料添加劑品種目錄》(2008)批準(zhǔn)使用的新型微生 物飼料添加劑。凝結(jié)芽抱桿菌不僅具有普通乳酸菌的益生保健功能，還具較強(qiáng)的耐胃酸、耐 高溫高壓、易培養(yǎng)和儲(chǔ)存等優(yōu)勢(shì)，是益生菌領(lǐng)域中的后起之秀，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、保健、食 品、畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域。
[0003]目前，市場(chǎng)上凝結(jié)芽抱桿菌產(chǎn)品制劑較多，但缺乏規(guī)范的管理及科學(xué)的評(píng)估手段 和參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，使得一部分微生態(tài)制劑生產(chǎn)廠家提供的產(chǎn)品質(zhì)量、價(jià)格參差不齊。市面上一些 廠家利用甲基營(yíng)養(yǎng)型芽抱桿菌、解淀粉芽抱桿菌、枯草芽抱桿菌或地衣芽抱桿菌冒充凝結(jié) 芽抱桿菌高價(jià)售賣，牟取暴利，嚴(yán)重影響了用戶對(duì)該類產(chǎn)品的選擇。因而，建立一種快速、高 效、準(zhǔn)確的鑒定方法顯得非常重要。
[0004]近年來(lái)分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，已有應(yīng)用PCR技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)， 檢測(cè)凝結(jié)芽抱桿菌的方法。CN102533743B"-種用于擴(kuò)增凝結(jié)芽抱桿菌的特異性引物及其 應(yīng)用"，公開(kāi)了通過(guò)特異性的擴(kuò)增comK基因來(lái)檢測(cè)凝結(jié)芽抱桿菌的方法，用該方法擴(kuò)增凝結(jié) 芽抱可獲得400bp的特異性片段，擴(kuò)增炭痘芽抱桿菌、蠟樣芽胞桿菌、枯草芽抱桿菌、紅球 菌時(shí)，則無(wú)特異性片段。該檢測(cè)方法僅擴(kuò)增凝結(jié)芽抱桿菌的一段基因序列，易出現(xiàn)假陽(yáng)性。
[0005] CN104152543A " -種凝結(jié)芽抱桿菌檢測(cè)引物組、試劑盒及其方法"，用該方法能從 凝結(jié)芽抱桿菌DNA中擴(kuò)增出大量的梯度大小核酸片段，而未能從其他屬細(xì)菌DNA中擴(kuò)增出 核酸片段。所述其他屬細(xì)菌為枯草芽胞桿菌、蠟狀芽抱桿菌、地衣芽抱桿菌、巨大芽抱桿菌 和大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株。
[0006]然而與凝結(jié)芽抱桿菌分子序列相似度較高的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽抱桿菌與解淀粉芽抱 桿菌，在上述方法中均沒(méi)有進(jìn)行檢測(cè)，難W保證檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。此外，巧光定量PCR和 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，存在儀器昂貴、人員要求較高或難定量、非特異性高等缺陷。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明提供一種快速檢測(cè)凝結(jié)芽抱桿菌的方法及多重PCR試劑盒，該方法檢測(cè)快 速準(zhǔn)確，敏感性高，且操作簡(jiǎn)單成本低。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種快速檢測(cè)凝結(jié)芽抱桿菌的方法，包括 W下步驟：
[0009] (1)提取樣品DNA ;
[0010] (2)PCR擴(kuò)增；所述PCR擴(kuò)增W樣品DNA為模板，用PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增；所述 PCR擴(kuò)增引物包含兩對(duì)PCR擴(kuò)增引物，分別為引物對(duì)1和引物對(duì)2 ;所述引物對(duì)1為coag-F和coag-R，引物對(duì)2為comK-F和comK-R;所述引物序列如沈QIDNO:1~4所示；
[0011] 做結(jié)果檢測(cè)。
[001引進(jìn)一步的是，所述步驟（2)PCR擴(kuò)增包括PCR總體系的配置和PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
[001引進(jìn)一步的是，所述PCR總體系容積為25μL包括PCR擴(kuò)增引物、PCR反應(yīng)試劑 (10XPCRMix)、DNA模板W及雙蒸水（dd&0)。
[0014] 進(jìn)一步的是，所述PCR總體系中各組分含量為：
[0015] 10XPCR Mix 12. 5 nL (id Ι?：0 9. 1 μ L· DNA模板 1.0 μ L· coag-F 0. 2 μ L·
[0016] 城過(guò)曼-R 0. 2 μ L comK-F 1.0 μ1., comK'-R 1.0 μ1.,
[0017] 進(jìn)一步的是，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性10min，94°C變性30s，54°C退 火30s，72°C延伸Imin，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后72°C溫育5min。
[0018] 進(jìn)一步的是，所述結(jié)果檢測(cè)的方法為瓊脂糖凝膠電泳。
[0019] 一種快速檢測(cè)凝結(jié)芽抱桿菌的多重PCR試劑盒，包含兩對(duì)PCR擴(kuò)增引物，分別為引 物對(duì)1和引物對(duì)2 ;所述引物對(duì)1為coag-F和coag-R，引物對(duì)2為comK-F和comK-R;所述 引物序列如SEQIDNO:1~4所示。
[0020] 進(jìn)一步的是，所述試劑盒包含PCR反應(yīng)試劑，陽(yáng)性及陰性對(duì)照樣品。
[0021] 本發(fā)明具有W下有益效果：提供的試劑盒和方法可W特異的擴(kuò)增凝結(jié)芽抱桿菌基 因組中的coag基因和comK基因序列，而不會(huì)擴(kuò)增得到其他細(xì)菌的基因片段，特異性強(qiáng)。特 別是與凝結(jié)芽抱桿菌分子序列相似度較高的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽抱桿菌與解淀粉芽抱桿菌，不能 擴(kuò)增得到基因片段。因此能夠準(zhǔn)確、有效的檢測(cè)出待檢樣品中是否存在凝結(jié)芽抱桿菌。并 且敏感性高、檢測(cè)快捷方便，可用于凝結(jié)芽抱桿菌樣品的快速檢測(cè)，幫助篩選性價(jià)比較優(yōu)良 的凝結(jié)芽抱桿菌產(chǎn)品，降低用戶經(jīng)濟(jì)損失。
【附圖說(shuō)明】
[002引 圖1為單一引物PCR擴(kuò)增電泳圖；
[002引 圖2為雙重PCR條件優(yōu)化；
[0024] 圖3為引物特異性檢測(cè)電泳圖；
[0025] 圖4為引物靈敏度檢測(cè)電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 結(jié)合W下具體實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0027] 實(shí)施例1
[002引 PCR擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)和效果
[002引一、實(shí)驗(yàn)方法
[0030] 1、PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)與合成
[0031] 根據(jù)GeneBank中凝結(jié)芽抱桿菌基因組的coaG基因序列和comK基因序列，用 Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，見(jiàn)表1。引物對(duì)1為coag-F和coag-R，分別擴(kuò) 增coaG基因的正向和反向序列，為SEQIDN0:1和SEQIDN0:2所示的序列；引物對(duì)2為 comK-F和comK-R，分別擴(kuò)增comK基因的正向和反向序列，為沈QIDN0:3和沈QIDN0:4 所示的序列。上述引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
[003引表1PCR擴(kuò)增引物資料
[0033]
[0034] 2、模板的制備
[0035] 按照無(wú)菌操作要求，將凝結(jié)芽抱桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CICC20138)接種于凝結(jié)芽抱桿 菌培養(yǎng)靜置培養(yǎng)36h，取2mL菌液提取DNA。液體培養(yǎng)基，37°C恒溫細(xì)菌基因組DNA提取操 作步驟如下：
[0036] (1)取過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌菌液4mL，10 00化/min離屯、Imin，盡量吸盡上清液。
[0037] 似向菌體沉淀中加入200μL緩沖液（稱取20mg的溶菌酶溶解在1血TE緩沖液 中，制成終濃度為20mg/血的溶菌酶液，0. 22μm微孔過(guò)濾后保存?zhèn)溆茫?7°C處理40min。[003引（3)向管中加入20μLProteinaseK溶液，混勻。
[003引 （4)加入220μL緩沖液GB，振蕩15s，70°C放置lOmin，溶液變清亮，簡(jiǎn)短離心去 除管蓋內(nèi)壁水珠。
[0040] (5)加入220μL無(wú)水乙醇，充分振蕩15s，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。
[0041] (6)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管 中），12 00化/min離屯、30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0042] (7)向吸附柱CB3中加入500μL緩沖液GD(使用前已加入無(wú)水乙醇），12 00化/ min離屯、30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[004引 做向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前已加入無(wú)水乙醇），12OOOr/ min離屯、30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0044] (9)重復(fù)操作步驟做。
[0045] (10)將吸附柱CB3放回收集管中，12 0(K)r/min離屯、2min，倒掉廢液，將吸附柱 CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，W徹底驚干吸附材料中殘留的漂洗液。
[0046] (11)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離屯、管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加 100μL無(wú)菌雙蒸水，室溫放置5min，12 0(K)r/min離屯、2min，將溶液收集到離屯、管中。
[0047] 3、單一引物的PCR擴(kuò)增
[0048] 取步驟2提取的凝結(jié)芽抱桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA作為模板，分別取步驟1中的 兩對(duì)引物按照W下程序分別擴(kuò)增：
[004引 （1)擴(kuò)增coag基因
[0050]PCR總體系為25μL各組分含量分別為：
[0051] 10XPCR Mix 12.5 μL (id Π,Ο 8.5 uL DNA模板 2. 0 μ ?., coag-F (10 ppm) 1.0 μL- coag-R (10 ppm) 1.0 μ ?-
[0052]反應(yīng)程序：94°(：預(yù)變性1〇111111，94°(：變性3〇3,60°(：退火3〇3,72°(：延伸1111111，擴(kuò)增 30個(gè)循環(huán)，最后72°C溫育5min。
[00閲 似擴(kuò)增comK基因
[0054] PCR總體系為25μL各組分含量分別為：
[00巧] 10XPCR Mix 12.5 μL dd Π,Ο 8.日μ L DNA模板 2. 0 μ L coffiK-F (10郵m) 1. 0 μ L cornK-R (10 ρρπι) 1.0 μ ?.
[0056] 反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性10min，94°C變性30s，53°C退火30s，72°C延伸Imin，擴(kuò)增 30個(gè)循環(huán)，最后72°C溫育5min。
[0057] 4、雙重PCR擴(kuò)增
[0058]W步驟2提取的凝結(jié)芽抱桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CICC20138)基因組DNA作為模板，取步 驟1中的兩對(duì)引物進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增。
[0059]PCR總體系為25μL各組分含量分別為：
[0060] 1 ο X PGR Mix 12. 5 μ L· dd化0 e.1bL 隨描模板 1. :0 b l cong-F 0 之iI :色0進(jìn)甚-R Q. 2 ii L :色o抽K-i 1. 0供L eofflK-K 1..:0供L
[0061]反應(yīng)程序：94°(：預(yù)變性1〇111111，94°(：變性3〇3,54°(：退火3〇3,72°(：延伸1111111，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后72°C溫育5min。
[00的]5.結(jié)果檢測(cè)
[0063] 取5μΙPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳，在恒壓120V條件下電泳 45min，置于凝膠成像系統(tǒng)下觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0064]二、結(jié)果
[006引 1、單一引物PCR擴(kuò)增結(jié)果
[0066] 如圖1所示，1號(hào)泳道為使用引物對(duì)1進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果，出現(xiàn)大小約為33化P的擴(kuò) 增片段；2號(hào)泳道為使用引物對(duì)2進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果，出現(xiàn)大小約為75化P的擴(kuò)增片段。
[0067] 兩個(gè)基因擴(kuò)增的目的片段測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTn比對(duì)分析，比對(duì) 結(jié)果顯示，測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中凝結(jié)芽抱桿菌coag基因和comK基因序列的相似性高達(dá) 98%~99%。
[006引 2、雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果
[0069] 如圖2所示，3號(hào)泳道為使用兩對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果，出現(xiàn)兩條清晰條帶，大小 分別約為345bp與769bp。
[0070] 本實(shí)例表明了本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物可W分別擴(kuò)增出目的基因序列，即擴(kuò)增出凝結(jié) 芽抱桿菌基因組中的coag基因與comK基因。并且用本發(fā)明所設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物進(jìn)行雙重 PCR，可W特異的擴(kuò)增出凝結(jié)芽抱桿菌基因組coag基因與comK基因，無(wú)其他任何雜帶。說(shuō) 明兩對(duì)引