分離式DNA支點(diǎn)介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)用于17β-雌二醇的檢測方法及檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境污染物檢測領(lǐng)域，涉及一種分離式DNA支點(diǎn)介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)用于17 β -雌二醇的檢測方法及檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]17 β_雌二醇是一類典型的環(huán)境污染源，廣泛存在于河流、土壤、水源、大氣以及農(nóng)產(chǎn)品中，屬于環(huán)境雌激素，是一種作用最強(qiáng)烈、最具潛在危害的內(nèi)分泌干擾物，可模擬內(nèi)源性雌激素行為。17 β -雌二醇一般以痕量存在，傳統(tǒng)的檢測方法主要是液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法、液質(zhì)聯(lián)用法等。但這些質(zhì)譜色譜技術(shù)需要麻煩的樣品預(yù)處理過程，需要昂貴的分析儀器，檢測時間較長，難以實(shí)現(xiàn)快速分析。
[0003]因此，開發(fā)一種操作簡單、成本低廉、可快速檢測在環(huán)境的17 β -雌二醇的方法以及相關(guān)檢測試劑盒具有重要意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于建立一種分離式DNA支點(diǎn)介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)用于17 β -雌二醇的檢測方法及檢測試劑盒。
[0005]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種分子檢測試劑盒，包括核酸序列、緩沖體系；核酸序列由核酸序列A、B、C、D、Ε和F組成；其中序列Α為待測分子的核酸適體；A中的部分序列與B互補(bǔ)；序列B具有a區(qū)和b區(qū)；序列C具有a*區(qū)和c區(qū)；序列D具有d區(qū)和b*區(qū)；序列E具有c*區(qū)和d*區(qū)；E的一端修飾有熒光基團(tuán)或淬滅基團(tuán)；序列F具有c區(qū)；F的一端修飾有與E對應(yīng)的淬滅基團(tuán)或熒光基團(tuán)；其中上述a、b、c、d區(qū)分別與a*、b*、c*、d*區(qū)序列互補(bǔ)配對。
[0006]優(yōu)選的，a、b、c區(qū)序列的長度獨(dú)立為9?21個堿基。
[0007]優(yōu)選的，序列D的d區(qū)域可作為DNA支點(diǎn)，其序列長度為4_10個堿基。
[0008]優(yōu)選的，熒光基團(tuán)包括？六1、073又75。
[0009]優(yōu)選的，淬滅基團(tuán)包括BHQ、金納米顆粒、量子點(diǎn)、石墨稀。
[0010]優(yōu)選的，緩沖體系為含鹽離子濃度的緩沖體系。
[0011]—種17β_雌二醇檢測試劑盒，包括核酸序列、緩沖體系，其特征在于:核酸序列由核酸序列A、B、C、D、Ε和F組成，其中
序列 Α:5，-GCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTAGCGGCTCTGCGCATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGC-3’ (SEQ ID NO: 1)；
序列 B:5’-TGCGCAGAGCCGCTA( b )CCCTCTGCGTGTAAT( a )_3’ (SEQ ID NO:2);
序列 C:5，-ATTACACGCAGAGGG( a* )AACTGCTAGCTTCAG( c )_3，(SEQ ID NO:3);
序列 D:5’-AGCTAC( d )TAGCGGCTCTGCGCA( b* )_3’ (SEQ ID NO:4);
序列 E:5’-FAM-CTGAAGCTAGCAGTT ( c*)GTAGCT ( d*)-3’ (SEQ ID NO:5);序列 F:5’-AACTGCTAGCTTCAG (c) -BHQ-3' (SEQ ID NO:6)。
[0012]優(yōu)選的，緩沖體系是10 mM Tris-HCl緩沖液，pH=8。
[0013]一種分子的檢測方法，包括如下步驟:
1)將核酸序列A和B溶于緩沖體系中，充分反應(yīng)，形成Α-B雙鏈核酸；
2)將核酸序列E和F溶于另一份緩沖體系中，充分反應(yīng)，形成Ε-F雙鏈核酸；
3)在步驟1)的緩沖體系中繼續(xù)加入待測樣品、核酸序列C、D，充分反應(yīng)后，再次加入步驟2)獲得的產(chǎn)物，繼續(xù)反應(yīng)；
4)根據(jù)反應(yīng)體系的熒光值變化情況確定待測分子的濃度；
其中，核酸序列A?F的結(jié)構(gòu)如上所述。
[0014]一種17 β -雌二醇的檢測方法，包括如下步驟:
1)將核酸序列Α和Β溶于緩沖體系中，充分反應(yīng)，形成Α-B雙鏈核酸；
2)將核酸序列E和F溶于另一份緩沖體系中，充分反應(yīng)，形成Ε-F雙鏈核酸；
3)在步驟1)的緩沖體系中繼續(xù)加入待測樣品、核酸序列C、D，充分反應(yīng)后，再次加入步驟2)獲得的產(chǎn)物，繼續(xù)反應(yīng)；
4)根據(jù)反應(yīng)體系的熒光值變化情況確定待測樣品中17β-雌二醇的濃度；
其中，核酸序列Α?F的結(jié)構(gòu)如上所述。
[0015]本發(fā)明的有益效果是:
(1)反應(yīng)過程可在溶液體系中一次完成，無需涉及核酸固定、洗滌、分離過程，操作簡單，檢測快速，方便用于快速檢測。
[0016](2)設(shè)計(jì)的分離式DNA支點(diǎn)無需莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA，設(shè)計(jì)簡單，該模式可用于檢測多種物質(zhì)，針對不同的核酸適體，修改對應(yīng)核酸序列，即可套用分離式DNA支點(diǎn)完成檢測。
[0017](3)本發(fā)明方法具有較高的靈敏度，可檢測到0.3 nM的17 β-雌二醇，線性范圍為1 ηΜ 到 400 ηΜο
【附圖說明】
[0018]圖1為本發(fā)明所述的檢測方法的原理圖；
圖2為對不同濃度17 β -雌二醇檢測的結(jié)果圖；
圖3為特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]一種分子檢測試劑盒，包括核酸序列、緩沖體系；核酸序列由核酸序列A、B、C、D、E和F組成；其中序列A為待測分子的核酸適體;A中的部分序列與B互補(bǔ)；序列B具有a區(qū)和b區(qū)；序列C具有a*區(qū)和c區(qū)；序列D具有d區(qū)和b*區(qū)；序列E具有c*區(qū)和d*區(qū)；E的一端修飾有熒光基團(tuán)或淬滅基團(tuán)；序列F具有c區(qū)；F的一端修飾有與E對應(yīng)的淬滅基團(tuán)或焚光基團(tuán)；其中上述a、b、c、d區(qū)分別與a*、b*、c*、d*區(qū)序列互補(bǔ)配對。
[0020]優(yōu)選的，a、b、c區(qū)序列的長度獨(dú)立為9?21個堿基。
[0021]更有選的，a、b、c區(qū)序列的長度獨(dú)立為15個堿基。
[0022]優(yōu)選的，序列D的d區(qū)域可作為DNA支點(diǎn)，其序列長度為4_10個堿基。
[0023]更優(yōu)選的，序列D的d區(qū)域的長度為6個堿基。
[0024]優(yōu)選的，熒光基團(tuán)包括？41彳73彳75。
[0025]優(yōu)選的，淬滅基團(tuán)包括BHQ、金納米顆粒、量子點(diǎn)、石墨稀。
[0026]優(yōu)選的，緩沖體系為含鹽離子濃度的緩沖體系。
[0027]—種17β_雌二醇檢測試劑盒，包括核酸序列、緩沖體系，其特征在于:核酸序列由核酸序列A、B、C、D、Ε和F組成，其中
序列 Α:5，-GCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTAGCGGCTCTGCGCATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGC-3’ (SEQ ID NO:1);
序列 B:5’-TGCGCAGAGCCGCTA( b )CCCTCTGCGTGTAAT( a )_3’ (SEQ ID NO:2);
序列 C:5，-ATTACACGCAGAGGG( a* )AACTGCTAGCTTCAG( c )_3，(SEQ ID NO:3);
序列 D:5’-AGCTAC( d )TAGCGGCTCTGCGCA( b* )_3’ (SEQ ID NO:4);
序列 E:5’-FAM-CTGAAGCTAGCAGTT ( c*)GTAGCT ( d*)-3’ (SEQ ID NO:5);
序列 F:5’-AACTGCTAGCTTCAG (c) -BHQ-3' (SEQ ID NO:6)。
[0028]優(yōu)選的，緩沖體系是10 mM Tris-HCl緩沖液，pH=8。
[0029]一種分子的檢測方法，包括如下步驟:
1)將核酸序列A和B溶于緩沖體系中，充分反應(yīng)，形成Α-B雙鏈核酸；
2)將核酸序列E和F溶于另一份緩沖體系中，充分反應(yīng)，形成Ε-F雙鏈核酸；
3)在步驟1)的緩沖體系中繼續(xù)加入待測樣品、核酸序列C、D，充分反應(yīng)后，再次加入步驟2)獲得的產(chǎn)物，繼續(xù)反應(yīng)；
4)根據(jù)反應(yīng)體系的熒光值變化情況確定待測分子的濃度；
其中，核酸序列A?F的結(jié)構(gòu)如上所述。
[0030]一種17 β -雌二醇的檢測方法，包括如下步驟:
1)將核酸序列Α和Β溶于緩沖體系中，充分反應(yīng)，形成Α-B雙鏈核酸；
2)將核酸序列E和F溶于另一份緩沖體系中，充分反應(yīng)，形成Ε-F雙鏈核酸；
3)在步驟1)的緩沖體系中繼續(xù)加入待測樣品、核酸序列C、D，充分反應(yīng)后，再次加入步驟2)獲得的產(chǎn)物，繼續(xù)反應(yīng)；
4)根據(jù)反應(yīng)體系的熒光值變化情況確定待測樣品中17β-雌二醇的濃度；
其中，核酸序列Α?F的結(jié)構(gòu)如上所述。
[0031]
以17 β-雌二醇的檢測為例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明的檢測原理(如圖1所示):
(1)核酸序列Α是17 β -雌二醇的核酸適體，能與17 β -雌二醇特異性結(jié)合。Β能與A部分序列互補(bǔ)。A和B先雜交，形成A-Β雙鏈核酸。
[0032](2)加入17 β-雌二醇，A能與17 β-雌二醇相互作用，