一種黃綠蜜環菌子實體抗肝癌活性甾醇類化合物的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及藥物化學及生物醫藥技術領域，尤其涉及一種黃綠蜜環菌子實體抗肝癌活性留醇類化合物的制備方法及其應用。
【背景技術】
[0002]肝癌細胞(hepatocellular carcinoma, HCC,以下簡稱肝癌)是一種惡性程度高、預后兇險的腫瘤，5年生存率只有7%左右，是全球第五位最常見的惡性腫瘤，在全世界腫瘤患者的致死率中高居第三位。我國肝癌發病人數約占全球的半數以上，發病年齡趨于年輕化。目前我國肝癌年死亡率為20/10萬左右，位居我國各種惡性腫瘤死亡率的第2位，并且近10年來一直呈上升趨勢。肝癌已經成為嚴重威脅我國人民健康和生命的一大殺手，其危險性不容忽視。
[0003]研究表明，一些中藥復方或單味藥的有效成分能誘導腫瘤細胞凋亡，其抗癌療效與中藥誘導腫瘤細胞凋亡有關。黃綠蜜環菌子實體是生長于青藏高原的珍稀野生食藥用菌。目前有限的研究表明，黃綠蜜環菌子實體中含有較豐富的蛋白質、氨基酸、糖類、生物堿和少量有機酸、黃酮、強心苷、留體三萜類、苷類、皂苷、揮發油、香豆素萜類、鞣質、酚類化合物等，該類化合物具有抗流感、防治神經炎、腳氣病、促進兒童發育、抗氧化及抗腫瘤等生物活性。
[0004]中國專利申請CN 103494843A《黃蘑菇標準化組分制法及其在肺癌治療中的應用》和CN 103494843A涉及了黃綠蜜環菌子實體標準化組分的制備方法及其在肺癌和肝癌中的應用，并未明確組分中的具體化學成分。文獻中對黃綠蜜環菌子實體化學成分的研究同樣極度匱乏。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題是提供一種工藝簡單、易于實施的一種黃綠蜜環菌子實體抗肝癌活性留醇類組分的制備方法。
[0006]本發明所要解決的另一個技術問題是提供該黃綠蜜環菌留醇類活性化合物在肝癌治療中的應用。
[0007]為解決上述問題，本發明所述的一種黃綠蜜環菌子實體抗肝癌活性留醇類化合物的制備方法，包括以下步驟:
[0008]⑴黃綠蜜環菌丙酮提取物加入其體積的I?6倍10%?50%正己烷-乙酸乙酯混合液進行溶解，溶解后過0.45 μ m的有機濾膜，得到含丙酮提取物的樣品溶液；所述含丙酮提取物的樣品溶液在以10 μ m硅膠為分離基質的制備色譜上分離并減壓干燥，即得Frl、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6、Fr7、Fr8、Fr9、FrlO、Frl2、、Frl3、Frl4 共 14 個標準化組分樣品；
[0009]⑵將所述14個標準化組分樣品采用iCelligence實時無標記細胞分析儀按下述步驟進行體外抗肝癌細胞模型篩選:
[0010]①確認iCelligence測試系統正確連接，37°C、5% 0)2培養箱工作正常；
[0011]②8孔細胞板內按150 μ L/孔加入培養基，室溫放置15分鐘后置于iCelligence測試臺上測基線；所述培養基是指含10%胎牛血清的低糖DMEM培養基；
[0012]③將所述14個標準化組分樣品中的每個組分樣品用DMSO配制成濃度為5mg/mL的樣品溶液；
[0013]④將對數生長期的人肝癌細胞H印G2，用胰酶按常規方法消化后，以950rpm的速率離心5min，將細胞重懸于所述培養基中，并將細胞濃度調至2.85 X 14個/mL，得到對數生長期的人肝癌細胞HepG2懸液，并按345 μ L/孔、每孔10000個細胞的量將所述對數生長期的人肝癌細胞ifepG2懸液接種入所述8孔細胞板的相應孔中，室溫放置30min ;
[0014]⑤將所述14個標準化組分樣品分兩批按每孔加5 μ L所述濃度為5mg/mL的樣品溶液、每孔加345 μ L所述對數生長期的人肝癌細胞H印G2懸液的量接種入所述8孔細胞板的相應孔中，并置于所述iCelligence測試臺，放入所述培養箱中開始檢測；45h后得到兩張黃綠蜜環菌子抗肝癌標準化組分的活性檢測圖；其中縱坐標為細胞指數，橫坐標為實時細胞增殖動態效應；
[0015]⑥根據所述兩張黃綠蜜環菌子抗肝癌標準化組分的活性檢測圖，當細胞增殖曲線呈現上升平緩或不上升的趨勢，則說明細胞分裂減緩或停止，即細胞不能進行正常的分裂，從而確定第7、第8、第9、第10、第11、第13以及第14號標準化組分具有體外抑制人肝癌細胞貼壁及增殖活性。
[0016]⑶將第8號標準化組分加入其體積的2?5倍5 %?20 %正己烷-乙醇混合液進行溶解，溶解后過0.45 μ m的有機濾膜，得到含第8號標準化組分的樣品溶液；所述含第8號標準化組分的樣品溶液在以10 μπι XAmide為分離基質的制備色譜上分離并減壓干燥，即得 Fr8-1、Fr8-2、Fr8_3、Fr8-4 共 4 個樣品；
[0017]⑷將所述4個樣品采用iCelligence實時無標記細胞分析儀按下述步驟進行體外抗肝癌細胞模型篩選:
[0018]①確認iCelligence測試系統正確連接，37°C、5% 0)2培養箱工作正常；
[0019]②8孔細胞板內按150 μ L/孔加入培養基，室溫放置15分鐘后置于iCelligence測試臺上測基線；所述培養基是指含10%胎牛血清的低糖DMEM培養基；
[0020]③將所述4個樣品中的每個樣品用DMSO配制成濃度為5mg/mL的樣品溶液；
[0021]④將對數生長期的人肝癌細胞H印G2，用胰酶按常規方法消化后，以950rpm的速率離心5min，將細胞重懸于所述培養基中，并將細胞濃度調至2.85 X 14個/mL，得到對數生長期的人肝癌細胞HepG2懸液，并按345 μ L/孔、每孔10000個細胞的量將所述對數生長期的人肝癌細胞ifepG2懸液接種入所述8孔細胞板的相應孔中，室溫放置30min ;
[0022]⑤將所述4個樣品分兩批按每孔加5 μ L所述濃度為5mg/mL的樣品溶液、每孔加345 μ L所述對數生長期的人肝癌細胞H印G2懸液的量接種入所述8孔細胞板的相應孔中，并置于所述iCelligence測試臺，放入所述培養箱中開始檢測；45h后得到兩張黃綠蜜環菌子抗肝癌標準化組分的活性檢測圖；其中縱坐標為細胞指數，橫坐標為實時細胞增殖動態效應；
[0023]⑥根據所述兩張黃綠蜜環菌子肝癌標準化組分的活性檢測圖，當細胞增殖曲線呈現上升平緩或不上升的趨勢，則說明細胞分裂減緩或停止，即細胞不能進行正常的分裂，從而確定第FrS-1號樣品和第Fr8-4號樣品具有體外抑制人肝癌細胞貼壁及增殖活性。
[0024]所述步驟⑴和所述步驟⑶中減壓濃縮的條件是指真空度為0.06?0.09MPa，溫度為 50 ?70°C。
[0025]所述步驟⑴中制備色譜分離的條件是指色譜柱尺寸為260 X 50mm ;采用A為正己燒、B為乙酸乙酯的二元流動相體系進行分離:0?15min，100% A?100% A ;15?35min，60% A?60% A ;35?50min，0% A?0% A ;檢測波長為260nm ;上樣量為1.0g。
[0026]所述步驟⑶制備色譜分離的條件是指色譜柱尺寸為250 X 20mm ;采用A為正己烷、B為乙醇的二元流動相體系進行分離:0?40min，97% A?92% A ;檢測波長為260nm ;上樣量為0.15或0.3go
[0027]如上所述的黃綠蜜環菌子實體抗肝癌活性留醇類化合物的制備方法所得的活性樣品其特征在于肝癌治療中的應用。
[0028]如上所述的黃綠蜜環菌子實體抗肝癌活性留醇類化合物的制備方法所得的活性樣品其特征在于:該活性樣品作為有效成分按常規方法與藥學上可接受的任何載體制成各類藥用制劑。
[0029]本發明與現有技術相比具有以下優點:
[0030]1、本發明采用制備色譜兩步純化，從黃綠蜜環菌子實體中分離得到了具有抗肝癌活性的樣品(參見圖1、圖3)，不但工藝簡單，而且易于實施。
[0031]2、本發明利用iCELLigence系統檢測，可實時動態檢測細胞貼壁和增殖過程，提供高信息量的細胞效應圖譜，提供大量、重要的動態反應信息；無標記、無創傷的電子檢測不會干擾細胞生長和分析；可高準確/精確度的定量衡量細胞生長，提供高于2個數量級的動態范圍；整個實驗過程自動收集數據，實時分析，大大改善僅僅在最終點分析的結果；在培養孔中檢測細胞質量，達到了活細胞品質控制的目的(參見圖2、圖4)。
[0032]3、本發明以細胞生長曲線為基本指標判定標準化組分和樣品對貼壁、繁殖等細胞生理活性的影響，結果直觀、易判斷；所得的留醇類活性樣品可用于研發制備抗肝癌治療藥物。
[0033]4、本發明拓展了抗肝癌藥物的原料來源，擴大了黃綠蜜環菌子實