一種使用家蠶制備鎮痛多肽的方法
【技術領域】
[0001]本發明公開了一種使用家蠶制備鎮痛活性多肽的方法，屬于基因工程領域。
【背景技術】
[0002]芋螺毒素是由海洋軟體動物芋螺iConus)分泌的一類用于自衛和捕食的活性肽類毒素。芋螺毒素分子質量小，通常由10-30個氨基酸殘基組成，大多富含半胱氨酸，具有高度保守的二硫鍵骨架。芋螺毒素種類繁多，可達5萬種以上，其一級結構多變，但信號肽及前導肽序列保守。根據保守的信號肽序列，芋螺毒素可分為^、1、0、1、？、S、T等超家族(superfamily)，再依據家族中毒素的半胱氨酸骨架，結合其藥理活性，又可分為α、μ、ω、δ、Ψ、σ、λ、κ、γ等家族(family)。芋螺毒素能特異性地作用于體內多種(鉀、鈉、鈣等)離子通道、細胞膜上的各種神經遞質和激素的受體，從而干擾細胞或神經中的信號傳遞。因此，在治療慢性疼痛、急性疼痛、癲癇、神經保護、心血管疾病、精神失常、運動失調、痙攣癥、癌癥及中風等方面具有廣泛的應用前景。如0-超家族中的ω-芋螺毒素可直接作用于鈣離子通道，阻斷痛覺傳遞，并具有鎮痛效應。由于芋螺毒素在作為分子探針用于神經藥理研究及作為新型藥物前導物開發臨床用新藥方面具有極高的研究和利用價值。在芋螺毒素中，ω -MVI ΙΑ來源于海洋生物幻芋螺(Corns magus,也稱僧袍芋螺)，能特異地阻斷鈣離子通道，阻止疼痛信號的傳導，以其為有效成分的Ziconotide (商品名Prialt?)已被FDA批準用于治療慢性疼痛(Terlau, Olivera.Conus venoms: a rich source of novel 1nchannel-targeted peptides.Phys1l Rev.2004， 84: 41_68)0
[0003]目前，芋螺毒素的獲得主要是依賴于芋螺的天然毒液的提取。但是，由于芋螺中芋螺毒素含量低，且大量采集海洋生物也不利于保持生態平衡。因此，利用經典的生化提取的方法直接從芋螺中分離芋螺毒素已經難以滿足研究和藥物生產的需要，從而使芋螺毒素的深入研究及開發受到一定限制。許多科學家希望采用多肽固相合成的方法來解決這一困難，其技術路線是通過分離天然芋螺毒素后測序或采用基因克隆方式獲得芋螺毒素序列，然后采用人工化學合成獲得更多量的芋螺毒素。一些結構簡單的芋螺毒素，如已經得到應用的ω-MVIIA，已可通過化學合成法來獲得。但是人工合成芋螺毒素的成本很高，還不能完全滿足作為藥物商業化生產的要求。因此，有科學家提出可將芋螺毒素的基因轉化到大腸桿菌或酵母等微生物中表達，但芋螺毒素的氨基酸序列短，后期分離純化比較困難，且翻譯后修飾復雜，在微生物表達系統中無法解決C端酰胺化的問題，不能獲得高活性的重組芋螺毒素(Zhan et al.A fus1n protein of conotoxin MVIIA and th1redoxinexpressed in Escherichia coli has significant analgesic activity.B1chemB1phys Res Commun.2003, 311: 495-500)。
[0004]家蠶桿狀病毒表達系統是以家蠶核型多角體病毒(BmNPV)為載體，家蠶為宿主的昆蟲桿狀病毒表達載體系統，其操作安全、表達水平高，能對重組蛋白進行糖基化、信號肽切除等翻譯后加工，獲得的重組蛋白具有比較完整的生物學功能。特別關鍵的是，研究發現家蠶抗菌肽CMIV具有C端酰胺化(屈賢銘，吳克佐，邱雪貞.經聚肌胞苷酸誘導家蠶蛹血淋巴中六種抗菌體的分離與鑒定.生物化學與生物物理學報.1986，18(3):284-291 )，說明家蠶中存在酰胺化途徑，在家蠶中有望解決芋螺毒素ω-MVIIA的C端酰胺化的問題，從而獲得高活性的重組ω-MVIIA。此外，家蠶桿狀病毒表達系統也可用于開發家蠶生物反應器，成本低廉，易于產業化。
[0005]本發明利用基因工程技術，構建了攜帶芋螺毒素ω-MVIIA基因的重組BmNPV病毒，采用小鼠醋酸扭體試驗證實，表達芋螺毒素ω-MVIIA的受感染家蠶的血液具有顯著的鎮痛活性。本發明為表達具有鎮痛活性的芋螺毒素ω-MVIIA提供了新的方法，具有潛在的應用價值。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于克服現有技術中對基因工程表達芋螺毒素ω-MVIIA的不足而公開一種表達具有鎮痛活性的重組芋螺毒素的制備方法及其應用。
[0007]本發明通過以下技術方案實現上述目的:
(1)根據BmNPV密碼子使用頻率優化芋螺毒素ω-MVIIA基因序列；
(2)合成優化后的ω-MVIIA基因，經BaiMl/HindVll雙酶切后，連入經同樣酶切的供體質粒pFastBacDual，并連入綠色熒光蛋白(EGFP)基因，構建重組供體質粒pFBD_MVIIA/EGFP ；
(3)采用Bac-to-Bac法，將重組供體質粒pFBD-MVIIA/EGFP上的ω-MVIIA基因和EGFP基因轉座到BmNPV，通過藍白斑篩選，獲得含有重組BmNPV的白色大腸桿菌菌落，從大腸桿菌中提取BmNPV基因組DNA，并進行PCR鑒定，篩選出含有ω -MVIIA基因的重組BmNPV，將其命名為νΒπΓ?;
(4)重組病毒感染的家蠶血液的鎮痛活性的驗證:經脂質體轉染獲得重組病毒BV粒子(出芽型病毒粒子)，借助綠色熒光檢測病毒滴度；用重組病毒的BV粒子注射家蠶，借助綠色熒光收集感染家蠶的血液，采用小鼠醋酸扭體法證實，該血液制備物具有顯著的鎮痛活性。
[0008]本發明的有益效果:
本發明根據家蠶核型多角體病毒(BmNPV)高效表達基因的密碼子使用頻率，優化了芋螺毒素ω-MVIIA基因序列，使之適合在BmNPV的天然宿主家蠶中表達。經化學合成密碼子優化的芋螺毒素ω-MVIIA基因后，借助基因工程手段，ω-MVIIA基因導入BmNPV，獲得重組病毒。小鼠醋酸扭體實驗證實，受攜帶芋螺毒素ω -MVIIA基因的重組病毒感染的家蠶血液具有明顯的鎮痛活性，小鼠的平均扭體次數僅為3.55次，明顯高于生理鹽水對照組(37.30次)。本發明還在重組病毒中導入了綠色熒光蛋白(EGFP)基因，借助綠色熒光不僅能檢測重組病毒BV粒子的滴度，還能檢測接種病毒的家蠶是否有效感染重組病毒。利用本發明所述方法，有望利用易于飼養的家蠶大量表達具有鎮痛活性的芋螺毒素ω-MVIIA，為其應用奠定基礎。
【附圖說明】
[0009]圖1:基因的密碼子優化。1:原始的基因序列，2:密碼子優化的基因序列，3:編碼的ω-MVIIA前體蛋白序列。
[0010]圖2:重組BmNPV的PCR鑒定結果。M:DNA marker ； 1-4:重組BmNPV擴增產物。
[0011]圖3:病毒感染的家蠶。1:普通BmNPV (vBm)感染的家蠶，無綠色熒光，2:感染重組BmNPV vBmMVD A/ESFP的家蠶，呈肉眼