一種真核細胞III型啟動子表達CRISPR sgRNA的方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本申請設及基因啟動子表達技術，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] Drosha:-種III型核糖核酸酶，通過識別mRNAs中類似于miRNAs前體的二級莖 環結構來定位和切割mRNAs，運在干細胞中抑制基因表達的機制中有重要作用。
[0003] 在生物體內，miRNA的成熟較siRNA雙鏈的形成過程要復雜，概括為：首先miRNA 的前體pri-miRNA在核內由一種稱為化osha酶處理后成為大約70nt的帶有莖環結構 的Pre州rsormiRNAs(pre-miRNAs)值enlietal.,2004;Gregoryetal.,2004;Hanet al. , 2004);運些pre-miRNAs在Expodin-5幫助下轉運到細胞核外之后再由胞質Dicer酶 進行處理，酶切后成為成熟的miRNAs(Lundetal.，2004;Yietal.，2003)。
[0004]CRISPR:規律成簇間隔短回文重復blusteredregularlyinterspacedshort palin化omicr巧eats)，細菌的II型CRISPR/Cas系統逐漸成為同時打祀多個基因位點的 重要工具。
[0005]shRNA:sho;rthai;rpinRNA,"短發夾RNA"。shRNA包括兩個短反向重復序列，克 隆到shRNA表達載體中的shRNA包括兩個短反向重復序列，中間由一莖環（loop)序列分隔 的，組成發夾結構，由polIII啟動子控制。隨后再連上5-6個T作為RNA聚合酶III的轉錄終 止子。在活體中輸送"小干擾RNA"(siRNA)的一種辦法是，將SiRNA序列作為"短發夾"克隆 進質粒載體中。當送入動物體內時，該發夾序列被表達出來，形成一個"雙鏈RNA"(shRNA)， 并被RNAi通道處理。
[0006] 高等生物通常都有復雜的基因網絡來確保細胞內的生物活動有條不素的進行。因 此，能夠同時打祀多個位點的分子工具對遺傳工程的基礎研究和實際應用都有巨大意義。 近年來，細菌的II型CRISPR/Cas系統逐漸成為達成運一目的的重要工具。從釀脈鏈球菌 中分離得到的化s9核酸內切酶通過人工修飾的引導RNA(guideRNA，gRNA)的導向作用可 W打祀DNA序列的5' -N20-NGG-3' (N代表任何脫氧核巧酸堿基），N20是與gRNA的5'序 列相同的20個堿基，NGG是PAM區（protospacer-adjacentmotif)。化s9剪切的位點就是 PAM附近的區域。運種可W人為修飾的導向RNA和基因組中PAM的高發率使得化s9-gRNA 幾乎可W打祀所有的基因元件來實現基因組編輯。正是由于它的簡單高效性，基于化s9的 基因編輯工具發展迅速，被用于基因組和表觀基因組編輯，轉錄調控和基因工程的其他應 用。
[0007] 從理論上來講，多基因編輯可W通過化s9和祀向不同位點的多個SgRNA-起表達 來實現。傳統的方法通過顯微注射或者表達包含多個單一gRNA(SgRNA)的表達盒來實現。 將體外表達的曲NA和化s9蛋白（或者化s9的mRNA)注射到細胞或者胚胎只適用于很少的 一些系統。因此，最理想的方法就是將多個SgRNA的表達盒壓縮到一個載體上。一個典型的 SgRNA的表達盒大約是400-5(K)bp，包含RNA聚合酶III任〇1III)的啟動子，SgRNA和化1 Ill終止子。受傳遞方式和質粒載體承載能力的限制，對于大多數生物來說，用運一sgRNA表達方法同時表達多個sgRNA將是一種挑戰。而且，真核生物III型聚合酶轉錄的RNA需 要有一個特定的核巧酸開始，運使得化s9/gRNA祀位點受限。一個好點的方法就是將多個 SgRNA的表達盒壓縮到一個合成的基因中，利用一個RNA加工系統從初級轉錄本中將單個 SgRNA分別剪切出來。應用到運一方法的成功案例只有利用Csy4內切核糖核酸酶和tRNA剪 切系統。（KabinXie,BastianMinkenber邑，Yinon邑Yan邑，Boostin邑CRISPR/Cas9multiplex editingcapabilitywiththeendogenoustRNA-processingsystem,PNAS)然而，還需要 更有效和精確的方法來同時產生多個SgRNAW提高多基因編輯的能力和充分發揮化s9系 統的應用。
[000引細胞中有大量的各種的RNA。在不同組織中，RNA的合成是高度保守的，并且有各 種精細的RNA加工系統來確保其正確的剪切。運一特點啟發我們可W用一個有內切酶功 能的RNA加工系統來從一個轉錄本切出多個SgRNA。最近在植物上的一個研究表明，多個 SgRNA可W由一個tRNA-gRNA結構的合成基因通過內源的RNase的精確剪切產生。化油in Xie,BastianMinkenberg,YinongYang,BoostingCRISPR/Cas9multiplexediting cap油ilitywiththeendogenoustRNA-processingsystem,PNA巧運一研究說明在植物 中不僅可W實現多基因打祀，而且大大提高了CRISPR/tas9系統用于基因組編輯的效率。 然而，類似的方法在動物中未見報道。
[0009] III型核糖核酸酶（RNaseIII) -直被認為在生物正常表達小RNA(miRNAs)的 過程中有關鍵作用。多年來，人們一直忽視了它們在其他RNA(例如SgRNA、shRNA等）的 產生過程中的重要作用。作為RNaseIII家族的一員，化osha就可W識別并切割信使 RNA(mRNAs)，并可能在核糖體RNA(rRNA)的加工過程中起作用。Drosha通過識別mRNAs中 類似于miRNAs前體的二級莖環結構來定位和切割mRNAs，運在干細胞中抑制基因表達的 機制中有重要作用。Dicer則可W通過調控許多小干擾RNA(smallinte計eringRNAs， siRNAs)的產生來調芐基因的表達，還可W促使細胞內有害的短RNA片段和病毒的RNA 降解來保護和維持細胞生物活動的正常。（TimothyΜ.Johanson,An化ewΜ.Lew,Mark M.W.Chong,MicroRNA-independentrolesoftheRNaseIIIenzymesDroshaand Dicer,RoyalSocietyPublishging)
【發明內容】
[0010] 本發明就是通過利用化osha的切割位點將多個SgRNA和shRNA的序列串聯起來， 通過一個真核細胞的III型啟動子啟動表達。從而實現同時產生多個SgRNAW提高多基因 編輯的能力和充分發揮化s9系統的應用。
[0011] 本發明是利用一個真核細胞III型啟動子扣6或H1)啟動由化osha切割位點串 聯的多個發卡結構小RNA的表達，在真核細胞內表達后可W產生多個有生物活性的CRISPR SgRNA(本發明的DNA序列圖示如下）。WU6-sgRNA-shRNA-sgRNA的結構為例，運種U6啟 動表達的結構在一次轉錄中產生含有多個SgRNA和shRNA的初級轉錄本，在真核細胞中 運些SgRNA經過加工后可W分別識別各自的祀位點，從而指導化s9蛋白打祀多個位點，為 多基因編輯打下基礎。相比于傳統的分別表達多個單一gRNA的方法和植物上新近報道的 tRNA-gRNA系統，本發明的結構更簡單，構建更方便。此外，本發明還可W通過Golden Gate 的方法繼續串聯shRNA-sgRNA的序列打祀更多的位點或者表達多個shRNA干擾基因的表 達。
【附圖說明】
[001引圖1 :本發明DNA序列結構圖；
[0013]圖 2 :Cas9 表達質粒（pll3. 7-SpCas9(Notl))圖；
[0014]圖 3:中間載體pcDNA3. 1 (+) -CMV-3RNA質粒圖；
[001引 圖4 :載體msgRNA-2的質粒圖；
[001引圖5 :質粒msgRNA-2酶切檢測結果；
[0017]圖6:雙巧光報告載體Re-SSA(CMV).VEGF的質粒圖；
[001引圖7 :雙巧光報告載體Re-SSA牌la).CCR5a的質粒圖；
[001引圖8 :VEGF位點報告載體檢測巧光效果圖（實驗組和陽性對照組）；
[0020] 圖9 :CC貼a位點報告載體檢測巧光效果圖（實驗組和陽性對照組）；
[0021] 圖10 :報告載體流式結果分析圖。
【具體實施方式】
[0022] 為使本發明的技術方案便于理解，W下結合利用III型啟動子U6表達祀向人基因 組VEGF基因和CCR5基因的具體試驗對本發明作進一步的詳細說明，所述是對本發明的解 釋而不是限定。
[0023] 實施例1祀位點選擇
[0024] 基于CRISPR/Cas9系統打祀位點的特點，在基因組中尋找含有PAM(NGG/NGGNG)的 祀位點。再經過〇?15口3〇631即網站化《口:/7^13口戶111^.6(111/)的篩選，選擇出^下兩個 位點作為祀位點：
[00巧]VEGF祀位點片段：
[0026]CTCGGCCACCACAGGGAAGCTGG(SEQIDN0:1)
[0027]CCR5a/CCR2 祀位點片段：
[0028]CACACTTGTCACCACCCCAAAGGTG(SEQIDNO:2)
[0029] 實施例2化s9蛋白表達載體
[0030] 將優化過的釀脈鏈球菌化s9序列化Sp化s9)插入到骨架載體pi13. 7中。如圖2 所示。hSpCas9的序列如下（SEQIDN0:3):
[0100] 實施例3串聯多個小RNA表達載體（msgRNA-。
[0101]W實驗載體為例，該載體設計為U6-sgRNA-shRNA-sgRNA結構，根據選擇的兩個革己 位點（VEGF祀位點和CCR5a祀位點），分別設計對應的sgRNA序列，中間用帶有化osha祀位 點的CD40shRNA序列。通過不同的限制性內切酶的酶切位點將各個片段連在一起。本實驗 使用的兩個化osha祀位點序列如下：
[0102] Drosha祀位點片段1:TCCGAGGCAGTAGGCA (SEQ ID NO:4)
[0103] Drosha祀位點片段2:TGCTGTTGACAGTGAGCG(SEQ ID NO:5)
[0104] 構建該載體需要兩步。第一步，將3個RNA序列的基因片段插入到骨架載 體pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen)上的多克隆位點Miel和Apal之間，各個片段之間分別 通過限制性內切酶EcoRI、化〇1和Apal各自識別位點的序列來連接，即化el-VEGF. sgRNA-EcoRI-CD40.shRNA-XhoI-CCR5a.sgRNA-Apal的結構。兩個sgRNA片段通過PCR引入 需要的酶切位點，CD40.shRNA片段通過酶切的方法獲得；第二步，用U6啟動子替換掉CMV 啟動子，最終獲得串聯表達多個小RNA的載體msgRNA-2。
[0105] 載體的具體構建和檢測方法如下：
[0106] 3.1引物的設計與合成
[0107] 分別W包含目的片段的載體為模板，利用CloneManagerV7軟件進行引物設計，設 計能夠特異擴增VEGF.SgRNA片段的引物化el-VEGF.Sps曲.F和EcoRI-SpsgR.R，能夠特異 擴增CCR5a.SgRNA片段的引物)(hoI-CCR5.a.SpsgRNA.F和Apal-SpsgRNA.R，能夠特異擴增 U6啟動子的引物Primer53(NdeI-冊L27-巧和Primer54(SacI-冊L27-R)。分別在相應的 位置引入所需的酶切位點。引物序列設計如表1 :
[0108] 表1:實驗引物設計表
[0109]
[0110] 其中：引物5'端的黑體斜體表示的堿基為酶切位點，前面的黑色字體為保護堿 基，帶下劃線的部分為與模板匹配的區域，剩下的黑色字體部分為引入的打祀序列。
[01川3.2 中間載體PCDNA3.1 (+)-CMV-3RNA的構建