抗菌肽cc34在枯草芽孢桿菌中的表達方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及分子生物領域，具體設及抗菌膚CC34在枯草芽抱桿菌中的表達方法。
【背景技術】
[0002] 抗菌膚是動、植物和人類先天性免疫機制的組成部分，在機體受到病毒、細菌等攻 擊時被誘導產生。抗菌膚具有廣譜抗菌作用，尤其是對一些產生抗生素耐藥性的病原菌的 殺滅作用更引起了人們對它的興趣。抗菌膚在農業、醫療、食品等領域的應用潛力巨大。迄 今為止，已經發現了上千種天然抗菌膚，但是具有較好的醫療選擇指數的種類卻比較少，因 此，人們希望通過分子上的重新設計，例如，雜合膚的設計等方式從豐富的天然抗菌膚資源 中獲得理想的新型人工抗菌膚。
[0003] 雜合抗菌膚的設計特點是集兩個（或W上）天然膚的優點于一身，經過適當的 人工修飾后，可W揚長避短，最大程度上發揮抗菌活性，并不引起溶血。天蠶素抗菌膚 (cecropins)是目前研究最清楚、效果最好的天然抗菌膚；家蛹天蠶素抗菌膚（CecMd)是 本實驗室經誘導家蛹幼蟲，然后克隆得到的（同源性81% )。而化ensirin是近年來發現 的中國東北林蛙皮膚上分泌的天然抗菌膚，其活性很高，但具有較高的溶血活性。通過對兩 者進行雜合設計，獲得了低溶血，高抗菌活性的新型雜合抗菌膚CC34,與天然膚相比具有很 大的優勢。本研究團隊已將抗菌膚CC34在大腸桿菌、畢赤酵母表達體系成功表達，尚未開 展在其他菌種表達體系方面的研究，為此，我們將抗菌膚CC34在枯草芽抱桿菌表達體系進 行表達研究。
[0004] 枯草芽抱桿菌度.Subtilis)作為外源基因的表達宿主，具有如下優點：（1) B.Subtilis是好氧菌不含熱源脂多糖（lipopolysaccharides，LPSs)，有益菌無致病性； B.Subtilis被美國FDA認可為安全性菌株。（2)B.Subtilis細胞膜為單層，而大腸桿菌的為 雙層，分泌的蛋白在B.Subtilis體系下比在大腸桿菌體系下更容易回收、純化，操作簡便， 許多酶都是B.Subtilis產生的分泌到胞外的蛋白。（3)長期的研究表明，B.Subtilis沒有 明顯的密碼子偏愛性。（4)B.Subtilis對培養基的要求比較簡單，在生產中絕對占有經濟 優勢，隧菌體、質粒都可作為克隆載體，B.Subtilis有良好的轉錄翻譯系統，可W避免形成 錯誤折疊的蛋白質、包涵體。（5)B.Subtilis的單基因、芽抱的形成等都受多基因調控；16S rRNA3'端的序列也有別于大腸桿菌。
【發明內容】
陽0化]為解決上述問題，本發明提供了一種分離純化簡單、蛋白純度高、適于大規模工業 化生產的抗菌膚CC34在枯草芽抱桿菌中的表達方法。
[0006] 為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：
[0007] 抗菌膚CC34在枯草芽抱桿菌中的表達方法，包括如下步驟：
[0008] S1、抗菌膚基因的合成及克隆載體的構建
[0009] S11、設計如下兩對四條引物，每對都具有互補序列 陽ο…]FI:5f-GCTCTAGAGGTTGGCTGAAAAAAATCGGCAAGAAGATTGA-3,
[0011]R1:5f-ACGGGTATGTTGGCCAACACGTTCAATCTTCTTGCCGATTTTTTTC-3'
[0012] F2 :5f-GGCCAACATACCCGTGATGCCATCCTGCCGATTCTGAGCCTGATTGGTGGTCTG-3'
[0013]R2:5'-TCCCCCGGGTTATTTACCCAGCAGACCACCAATCAGGCTCAGAATC-3'
[0014]S12、將引物FI與Rl、F2與R2在如下的PCR反應體系中分別進行延伸，得到延伸 液P1、P2。具體步驟如下（WP1的PCR反應體系為例）：提前開起PCR儀預熱，將2X化q MasterMix25μL、上游引物F1 (10μΜ) 2μL、下游引物R1 (10μΜ) 2μL、RNase-Freewater 21μL加入到PCR反應管中，混合均勻，瞬時離屯、后，置于PCR儀中。反應條件為：94°C預變 性2min;30個循環；72°C終延伸2min，得延伸液P1。同理，可獲得延伸液P2 ;
[0015]S13、W第一次PCR得到的延伸液P1與P2相互作為彼此的模板和引物進行PCR， 具體步驟如下：提前開起PCR儀預熱，將2XTaqMasterMix25yL、Pl0. 5yL、P2 0. 5yL、 RNase-Freewater24μL加入到PCR反應管中，混合均勻，瞬時離屯、后，置于PCR儀中，反應 條件為：94°C預變性2min;30個循環；72°C終延伸5min，得抗菌膚基因；
[0016] S14、將所得的抗菌膚基因與克隆載體PMD18-T載體連接，在0. 2mL微量離屯、管中， 加入PMD18-TVectorlμレ膠回收后的抗菌膚基因2 (1地2〇 2Solution1 (冰上 融化）5μ^全量為lOyL;混合均勻，瞬時離屯、后，置于連接儀中，4°C，1化，得pMD18-T/CC：M; 陽017] S15、將含有表達載體PHT43的大腸桿菌接種到3mL含有10μg/mLCm的LB培養 基中，37°C20化pm振蕩過夜培養，提取質粒，將其與-20°C保存的鑒別正確的克隆質粒分 別進行雙酶切，酶切體系如下：甜allyLSaml1μ^質粒DNAlOyL^tSmartBuffer 2yL、滅菌的雙蒸水6yL;酶切反應條件為：37°C水浴，3h，其中質粒DM分別為：pHT43、 pMD-18T/CC：M質粒；
[0018] S16、取上述試劑于PCR反應管中，混勻后瞬時離屯、，使溶液聚集在試管底部，37°C 水浴化后，酶切反應完全；
[0019] S17、將酶切好的CC34基因片段和酶切后的質粒PHT43進行連接，即可構建成質粒 載體PHT43/CC34,連接反應體系如下：CC34基因eyLlOXTADNAligaseBufferlμレ質 粒pHT43 2. 5μ^Τ4DMligase0. 5yL;連接反應條件為：16°C水浴，過夜；
[0020]S2、重組表達載體PHT43/CC34轉化到宿主細胞中，構建Ξ種表達工程菌菌株；
[0021] S3、將步驟S2得到的表達工程菌WIPTG為誘導劑表達，獲得表達產物；
[0022]S4、分離純化步驟S3所得的表達產物，獲得抗菌膚蛋白CC34,并檢測其正確性。
[0023] 其中，所述步驟S2中的宿主細胞為枯草芽抱桿菌WB800N。
[0024] 其中，所述步驟S3中所述表達產物為離屯、上清液。
[0025] 其中，所述步驟S4中所述分離純化采用高效液相色譜法OPLC)純化，利用質譜法 (M巧檢測其正確性。
[00%] 上述分離純化鑒定正確的抗菌膚CC34,在制備治療革蘭氏陰和/或革蘭氏陽性菌 疾病藥物、動物飼料添加劑中的應用。
[0027] 其中，所述步驟S12和步驟S13中的30個循環為94°C變性30S，66 °C退火30S，72°C 延伸30s。 陽02引本發明選擇PHT43作為表達載體，PHT43載體中插入了一個多克隆位點度amHI， 甜aI，AatII，SmaI)和高效SD序列，所選擇的酶切位點是甜al和Smal。而宿主菌又有多 種，但是天然的B.Subtilis在胞外分泌過程中會分泌一些胞外蛋白酶，可能會改變目的蛋 白的基本性能，所W出現了很多敲除可W分泌胞外酶基因的B.Subtilis，如WB600、WB700、 WB800N等，本發明選擇敲除了 8個基因的WB800N為宿主菌。
[0029] 本發明具有W下有益效果：
[0030] 本發明應用基因工程技術在枯草芽抱桿菌中高效表達了抗菌膚CC34,經實驗證 實種抗菌膚對多種細菌有殺菌作用，表達產物穩定性較好，分離純化簡單，易操作，易放大， 適于大規模工業化生產，對研制新型高效的CC34抗菌飼料添加劑、抗菌藥物等具有重要價 值。
【附圖說明】
[0031] 圖1為本發明實施例中第一次PCR產物電泳圖。其中，1為DNA標準分子量；4 :P2 片段75bp;6為P1片段62bp。
[0032] 圖2為本發明實施例中第二次PCR產物電泳圖。其中，1為DM標準分子量；3為 雜合抗菌膚CC34 12化P。
[0033]圖3為本發明實施例中重組克隆質粒為模板PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，2 為雜合抗菌膚CC34 122bp;4為DNA標準分子量；5為陰性對照。
[0034]圖4為本發明實施例中重組克隆質粒雙酶切產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，1、5 為DNA標準分子量；2為雜合抗菌膚CC34 12化P;4 :陰性對照。
[0035] 圖5為本發明實施例中重組表達載體的PCR鑒定。其中，4為重組載體CC34PCR 產物293bp。引物分別為：
[0036] F34 :5' -TTTGTCAGTTTGCCGATTAC-3'
[0037]R34 :5' -CTATTCCTAATAAGCCGATA-3'
[0038]圖6為本發明實施例中重組質粒的酶切鑒定。其中，1為DNA標準分子量；2為重 組載體CC34酶切產物12化P。
[0039] 圖7為本發明實施例中3條抗菌膚的化icine-SDS-PAGE分析。其中，1為空質粒 上清液；2為CC34樣品上清液3. 7kDa;5為標準蛋白Marker。
【具體實施方式】
[0040] 為了使本發明的目的及優點更加清楚明白，W下結合實施例對本發明進行進一步 詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用W解釋本發明，并不用于限定本發 明。 陽04U 實施例1 :
[0042] (1)構建表達載體：
[0043]a抗菌膚基因的合成及克隆載體的構建
[0044] 采用SOEingPCR技術來完成雜合抗菌膚CC34在體外的基因合成。抗菌膚設計如 下兩對四條引物，每對都具有互補序列，經過兩步PCR合成抗菌膚基因，并與pMD18-T克隆 載體相連，形成克隆重組質粒pMD18-T/CC34。
[0045] CC：M氨基酸序列：GWLKKIGKKIERVGQHT畑AILPIL化IGGLLGK
[0052] 采用SOEingPCR方法合成抗菌膚基因結果如圖1、2,方法如下：
[0053] 第一次PCR時，F1與R1、F2與R2分別進行延伸，得到延伸液P1、P2、。反應體系 如下（WF1與R1為例）：
[0054]
陽化日]提前開起PCR儀預熱，將上述試劑加入到PCR反應管中，混合均勻后瞬時離屯、，放 入PCR儀中。反應條件為：94°C預變性2min;30個循環（94°C變性30s，63°C退火30s，72°C 延伸30s) ;72°C終延伸2min。待反應結束，從中取5μΙ進行電泳檢測（含有邸的1.5% 瓊脂糖凝膠），剩余的部分暫-4Γ存放。
[0056] 第二次PCR時，W第一次PCR得到的相應延伸液（Ρ1與Ρ2)相互作為彼此的模板 和引物進行PCR，反應體系如下：
[0057]
[0058] 提前開起PCR儀預熱，將上述試劑加入到PCR反應管中，混合均勻后瞬時離屯、，放 入PCR儀中。反應條件為：94°C預變性2min;30個循環（94°C變性30s，66°C退火30s，72°C 延伸30s) ;72°C終延伸5min。待PCR結束變得到CC34基因，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對合 成的基因進行檢測。
[0059]目的基因與克隆載體的連接： W60] 將抗菌膚基因與克隆載體PMD18-T載體