枸杞谷胱甘肽合成酶基因與克隆方法及在耐逆性方面應用
【技術領域】
[000。 本發明設及一種構杞（如。心曲紐ineftse必/心如中谷脫甘膚合成酶基因及其在 增強植物耐鹽堿能力方面的應用，具體為構杞中谷脫甘膚合成酶基因筑的克隆、重組 及應用。
【背景技術】
[0002]植物在生長發育過程中不斷遭受各種生物及非生物的脅迫。如干旱、鹽堿、寒冷、 高溫及病原菌的侵染等，與能移動的動物不同，植物在長期進化過程中發展起一套完善和 適合其自身需要的信號轉導系統W適應環境變化，更好地生存。植物受到刺激后，會產生物 理或化學信號，運些信號到達祀細胞后轉換成胞內信號，并啟動細胞內各種信號轉導系統， 繼而對原初信號進行級聯放大，使一些基因的表達受逆境調控，最終導致生理生化變化。
[0003]植物對干旱和高鹽等逆境的抗性是受多基因控制的一個復雜的過程，而運些抗逆 基因的表達多是受逆境環境調控的，當植物感受到外界的生物、非生物脅迫信號時，機體的 逆境調控的抗逆相關基因才會表達。谷脫甘膚（Glutathione,G甜）是廣泛分布于植物 和微生物細胞內最主要、含量最豐富的含琉基的低分子膚。1929年由化pkins最早發現并 對其予W命名，是一種由谷氨酸、半脫氨酸和甘氨酸組成的Ξ膚化-谷氨酷-L-半脫氨 酷-甘氨酸），分子式為。訊17〇苗噸。G甜作為生物體內主要的還原態硫之一，在生物體抵抗 各種脅迫（冷害、干旱、重金屬、真菌等）的過程中起著重要的作用，其含量水平的高低與 植物對各種環境脅迫的忍耐程度密切相關，同時也可能是生物體內其調節作用的信號分子 之一。近些年來，它在高等植物代謝過程中的生理作用，尤其是在植物抵御活性氧傷害過程 中的作用及其與植物抗逆性關系的研究進展很快。
[0004]Bloch等最早研究了GSH的生物合成，并證實了細胞內的GSH是由丫-谷氨酷半 脫氨酸合成酶（丫-EC巧與GSH合成酶（G巧在ATP存在下催化L-谷氨酸α-精氨酸和甘 氨酸的序貫反應在細胞內合成的。GSH通過細胞膜時與分布在細胞膜外側的γ-谷氨酷轉 膚酶反應，G甜的丫 -谷氨酷部分便轉移到某些氨基酸上。由此生成的丫-谷氨酷氨基酸 再被運進細胞并在γ-谷氨酷基環化轉移酶的作用下裂解為相應的氨基酸和5-徑基脯氨 酸。5-徑基脯氨酸再在5-徑基脯氨酸酶的催化下轉化為k谷氨酸。在丫-谷氨酷轉膚 酶的作用下生成的半脫氨酸甘氨酸部分則被半脫氨酸甘氨酸雙膚酶作用，裂解為半脫氨酸 和甘氨酸，分別作為丫 -ECS和GS的底物。運6種酶催化的6個反應便組成了動物中GSH 合成和降解的丫-谷氨酷循環。GS和丫-ECS兩種酶都已在植物組織中發現和純化，而且功 能也已證實。兩種酶在葉綠體和其他細胞器均有分布。
[0005] 高等植物體內谷脫甘膚的功能主要體現在W下幾個方面：（1)維持細胞膜的完整 性、清除體內自由基；（2)參與氨基酸的吸收和轉運，促進細胞合成蛋白質；（3)參與了氨 基酸的吸收，進而促進蛋白質的合成；（4)解毒作用；（5)GSH在重金屬脅迫中起著重要 的作用；（6)谷脫甘膚參與植物環境脅迫的應答；谷脫甘膚分為氧化型（GSSG)和還原型 (GSH)。通常所說的谷脫甘膚為還原型谷脫甘膚，其半脫氨酸上的琉基是其發揮生物學功能 所必需的。還原型谷脫甘膚是植物中含量最豐富的含琉基的低分子膚，為植物機體內的重 要活性物質，它參與二硫化物、硫酸和硫醋的形成，并能清除生物體內的自由基，是胞內代 謝過程和植物遭受氧化脅迫時所產生的過氧化物的最有效的清除劑之一。植物機體內的氧 化型谷脫甘膚可W轉化為還原型谷脫甘膚，還原型谷脫甘膚與氧化型谷脫甘膚含量的比值 是反映植物體內谷脫甘膚活性的重要指標之一。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種構杞谷脫甘膚合成酶基因（Zc貨)。
[0007] 本發明的第二個目的是提供該基因編碼的蛋白質化cG巧。
[0008] 本發明的目的還在于提供含有該基因的重組載體（pMD18-T-LcG巧和宿主細胞 (畑5α)。
[0009] 本發明的另一個目的在于提供該基因的用途。
[0010] 本發明提供的一種構杞谷脫甘膚合成酶基因Uc仿)，如序列表中SEQIDNo. 1所 示的核巧酸序列構成。
[0011] 本發明提供的一種構杞谷脫甘膚合成酶基因筑編碼的蛋白質，如序列表中 SEQIDNo. 2所不的氨基酸序列的蛋白質。
[001引本發明提供的一種構杞谷脫甘膚合成酶基因筑的重組克隆載體pMD18-T-LcGS0
[0013] 含有上述的構杞谷脫甘膚合成酶基因筑的重組載體，運些重組載體包括質 粒。
[0014] 含有上述構杞谷脫甘膚合成酶基因筑的完整編碼閱讀框序列的宿主細胞，如 含有上述重組載體（pMD18-T-LcG巧的宿主細胞（D冊α)也屬于本發明的保護范圍。
[0015] 本發明提供了一種含有基因的工程菌。
[0016] 本發明的克隆方法由下述步驟組成： 從構杞新鮮葉片中提取總RNA，根據轉錄組化igene序列中構杞谷脫甘膚合成酶基因 的核巧酸序列設計上游引物LcGS-Fl:5'-TCAAAGAGGTCAGGCACTGTTCC-3'（沈QIDNo. 3)， 1。65。斗2:5'-6446〇：了664176了4了67^了6-3'（沈9 10齡.4)然后利用3'^〔6方法擴增 得到谷脫甘膚合成酶基因的3'末端序列，將轉錄組化igene中的序列與得到的3'末端序 列拼接設計全長擴增引物GS-Full-F:ATGGGCAGTGGCTATTCCT(沈QIDNo. 5) ;GS-Full-R: TGTCTCTAGCAGAACAGTAAAGG(沈QIDNo. 6) ;PCR擴增獲得構杞Zc齡的全長序列。
[0017] 本發明構建含谷脫甘膚合成酶基因Zc仿前大腸桿菌的中間載體pMD18-T-LcGS。 由下述步驟組成： WGS-Full-F/Ril1-R為引物，W構杞cDNA為模板，進行PCR擴增，將PCR擴增產 物連接于PMD18-T載體，獲得含有序列表中SEQIDNO. 1所示的Zc仿基因的中間載體 pMD~18~T~LcGS〇
[0018] 本發明研究了構杞在不同時間的鹽堿脅迫下，構杞谷脫甘膚合成酶的表達量的變 化，由下述步驟組成： 提取不同時間鹽脅迫下構杞葉片的總RNA，測定RNA濃度，反轉錄合成CDNA，W LcGS-F2/GS-Full-R為引物，cDNA為模板，通過半定量PCR測定鹽脅迫下構杞谷脫甘膚合成 酶的表達量。
[0019] 本發明研究了構杞在不同時間的重金屬脅迫下，構杞谷脫甘膚合成酶的表達量的 變化，由下述步驟組成： 提取不同時間重金屬脅迫下構杞葉片的總RNA，測定RNA濃度，反轉錄合成cDNA，W LcGS-F2/GS-Full-R為引物，cDNA為模板，通過半定量PCR測定鹽脅迫下構杞谷脫甘膚合成 酶的表達量。
[0020] 本發明提供了一種構杞谷脫甘膚合成酶及其在增強構杞等植物耐逆性能力(例 如耐鹽、耐重金屬）方面的應用。通過提取新鮮構杞葉片中的總RNA，利用3'RACE方法克 隆構杞中的谷脫甘膚合成酶基因得到基因完整的序列為208化P，包含一個1683bp 的開放閱讀框（0RF)，編碼560個氨基酸，3'非編碼區398bp，該基因的cDNA序列還包含 24bp的polyA尾。利用ExPASy數據庫ProtParam軟件在線分析的結果顯示，其蛋白分子 量62. 65kD，理論等電點為6. 16。通過半定量PCR研究分析了構杞在不同時間鹽脅迫和重 金屬脅迫下的表達分析，進一步解明了構杞在脅迫下的應答機制。
[0021]
【附圖說明】
[0022] 圖1.LcGS-F2引物擴增Zc仿電泳圖。
[002引 圖2.Zc仿全長擴增電泳圖。
[0024]圖 3.pMD18-T-LcGS載體示意圖。
[00巧]圖4.LcGS與其它植物GS多重序列比對。
[002引圖5.不同時間鹽處理下Zc仿前表達分析。
[0027] 圖6.不同時間重金屬處理下前表達分析。
[0028]
【具體實施方式】
[0029] 實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件W及手冊中所述的條 件，或按照制造廠商所建議的條件；所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得 至IJ。實施例1 構杞中谷脫甘膚合成酶基因的3'末端克隆 利用化izol試劑，從lOOmg的新鮮的構杞葉片中提取totalRNA，根據轉錄組的 化igene序列設計上游引物，構杞中谷脫甘膚合成酶Zc仿基因的上游引物為：1^65斗1:5'-TCAMGAGGTCAGGCACTGTTCC-3'，LCGSF-F2:5 '-GMGCCTGGATTGTATGTTATG-3'，利用3'FULLRACE Core Set Ver. 2.0 (TaKaRa，Japan)試劑盒擴增得到LcGS基因的3'末端序列。具體步 驟：①Wtotal RNA為模板，利用3'RACE Adaptor引物進行反轉錄反應，合成1st Strand cDNA，反應體系如下：
反應條件：42°C，60min;70°C，15min。
[0030] 根據基因的上游引物與試劑盒提供的下游引物3'RACEoutprimer:5'-TACCGTCG TTCCACTAGTGATTT-3'，WlStStrandcDNA為模板，進行PCR反應，反應體系如下：
反應條件如下：94°C，4min; 94°C，30Sec;56°C，30Sec;72°C，90Sec;34 巧cle， 72°C，lOmin。將上述PCR擴增產物稀釋40倍取1. 5uL作為模板，WLcGS-F2/3'RACEout primer為引物，其他反應液與上述條件一致，反應條件如下：94°C，4min; 94°C，30Sec; 56°C，30Sec;72°C，70Sec;