蚜蟲基因的dsRNA及其在降低蚜蟲存活率中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程技術領域，具體設及一種曬蟲基因的dsRNA及其在降低曬蟲 存活率中的應用。
【背景技術】
[0002] 曬蟲是危害作物生產的主要害蟲之一，近年來全球氣候變暖、耕作制度變化等因 素使曬蟲的繁殖能力和適應性顯著增強，其危害日趨嚴重。據統計，2010~2011年間我 國小麥、玉米、棉花、油菜、大豆等主要作物的曬蟲危害面積分別占當年種植面積的62. 5%、 14%、90%、32%和23%。W麥曬為例，麥曬W成若曬聚集在小麥葉部、莖部、穗部等，吸食汁液 造成葉片不規則皺縮、卷曲、失綠，嚴重時造成植株死亡。麥曬分泌的蜜露附著在植株表面， 降低植株的光合作用，并易誘發煤煙病等。同時，麥曬還是黃矮病毒重要的傳播載體，引起 小麥黃矮病流行。據全國農作物病蟲監測網預報，2013年我國麥曬危害面積高達2. 5億畝， 其中河南省麥曬危害面積為5500萬畝。目前，曬蟲防治W噴灑農藥為主，但大量使用農藥， 不僅對人畜有害，而且造成了嚴重的環境污染。而培育抗蟲作物品種是防止曬蟲為害的最 有效途徑之一，但由于農作物現有種質資源中缺乏有效的抗曬基因，且抗性機制不明確，常 規抗蟲育種難W奏效。因此，利用轉基因技術培育抗曬新種質，對于保障我國糧食安全和環 境安全具有重要意義。
[0003] 植物介導的RNAi(RNA干擾）技術能特異抑制昆蟲特定基因的表達，使昆蟲的 生長發育受阻或致死，進而有效控制害蟲危害，已成為農作物抗蟲基因工程研究的熱點之 一。RNAi現象是由dsRNA(double-strandedRNA)介導的一種序列特異性轉錄后基因沉 默機制，dsRNA進入生物體后被宿主細胞中的Dicer酶切割成21~23nt的siRNA(small inte計eringRNA) ;siRNA在RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，反義siRNA與體 內一些酶(包括內切酶、外切酶、解旋酶等）結合形成RNA誘導的沉默復合物（RNA-imluced silencingcomplex,RISC),繼之RISCW序列互補的方式與勒ImRNA結合并使之降解，造成 祀標基因表達量下降。利用dsRNA體外飼喂或注射來篩選RNA祀標基因，導致祀標基因表 達和沉默，已經廣泛應用于昆蟲生長發育關鍵基因的鑒定和功能分析。孟山都公司通過植 物介導的昆蟲腸道特異基因RNAi技術成功獲得了抗玉米根懼的轉基因玉米，有效緩解了 長期應用化轉基因玉米誘發昆蟲產生抗性等問題，目前已完成生產性試驗。棉鈴蟲腸道中 特異P450基因可提高棉鈴蟲幼蟲對棉花次生代謝物質和棉酪的耐受性，試驗表明，利用表 達棉鈴蟲P450基因dsRNA的轉基因煙草和棉花葉片飼喂棉鈴蟲幼蟲，可導致幼蟲體內P450 基因的表達量下降，同時幼蟲發育受阻，表現出抗棉鈴蟲性能。近年來，RNAi技術在曬蟲防 治方面也展示出很好的應用前景。在煙草和擬南芥中表達曬蟲必如A基因或絲氨酸蛋白酶 妳況莖因的dsRNA均可顯著降低曬蟲的繁殖率，進而減輕曬蟲危害。
[0004] 鑒于曬蟲對農業生產造成的巨大損失，且農作物現有種質資源中缺乏有效的抗曬 蟲基因，常規抗曬蟲育種難W奏效；挖掘和鑒定新型抗曬基因或曬蟲dsRNA，利用轉基因技 術培育抗曬新種質，對于保障我國糧食安全和環境安全具有重要的意義。
【發明內容】
[0005] 針對上述問題，本發明提供一種曬蟲基因的dsRNA，可利用RNAi技術沉默曬蟲 莖因，導致曬蟲產生致死效應。
[0006] 為解決W上問題，本發明通過W下技術方案實現： 設計一種曬蟲基因的dsRNA，具體為由SEQIDNo:1所示序列的核巧酸和其反向互補 序列的核巧酸組成的雙鏈RNA。對應的，對該序列經簡單缺失、修飾等變換后，使其能達到基 本相同抑制效果的核巧酸序列，也應當是與該序列實質上相同的發明。
[0007] 編碼所述dsRNA的DNA分子也屬于本發明的保護范圍，所述DNA分子的核巧酸序 列如SEQIDNo:2所示。
[0008] 含有所述DNA分子的表達盒、重組載體或重組菌也屬于本發明的保護范圍。
[0009] 所述dsRNA、或所述DNA分子、或所述表達盒、重組載體或重組菌，在如下（1)~(3) 任一項中的應用也屬于本發明的保護范圍： (1) 防治曬蟲或制備防治曬蟲的產品； (2) 降低曬蟲存活率或制備降低曬蟲存活率的產品； (3 )抑制曬蟲莖因表達或制備抑制曬蟲莖因表達的產品。
[0010] 所述應用為將所述dsRNA導入曬蟲，從而實現防治曬蟲、降低曬蟲存活率或抑制 曬蟲莖因表達。
[0011] 在本發明中，所述導入的方式具體為飼喂。
[0012] 更加具體的，所述飼喂方法為：將所述dsRNA混合于液體飼料中，得到混合液，用 所述混合液飼喂曬蟲；所述dsRNA在所述混合液中的終濃度優選為10ng/yL;所述飼喂持 續的時間為2天W上，優選2~8天。
[0013] 活性成分為如下A~C中任一種的產品也屬于本發明的保護范圍： A、 所述dsRNA; B、 所述DM分子； C、 所述表達盒、重組載體或重組菌； 所述產品具有如下（1)~（3)功能中的至少一種： (1) 防治曬蟲； (2) 降低曬蟲存活率； (3) 抑制曬蟲莖因表達。
[0014] 在本發明中，所述曬蟲可為麥曬，所述麥曬為麥長管曬，具體為3齡麥長管曬。
[0015] 在本發明中，所述曬蟲莖因的核巧酸含有如SEQIDNo:2所示序列。
[0016] 本發明具有的積極有益的技術效果： 1.實驗證明，本發明得到了麥長管曬SaUPcDNA序列的dsRNA，采用體外飼喂dsRNA方 法，進行了利用RNAi技術沉默麥長管曬SaUP基因，導致麥長管曬產生致死效應，并且隨著 飼喂時間延長，麥長管曬的死亡率均逐漸增加；顯然該dsRNA及其對應的表達盒、重組載體 或重組菌等產品在曬蟲防治領域有著重要的應用價值。
[0017] 2.眾所周知的是，RNAi是根據序列特異性進行基因沉默的，而大多數已知曬蟲品 種的SaUP基因序列和麥長管曬SaUP相似性較高(例如只需要有3個2化P的相同序列)，即 可引起相關基因的沉默。因不同類型曬蟲的同源基因序列相似性較大，所W本發明dsRNA也可廣泛用于其它種類曬蟲的防治。
[001引 3.對飼喂后曬蟲SaUP基因實時巧光定量PCR研究表明，Saw莖因的表達明顯受 到抑制；運表明曬蟲莖因的序列可應用于通過植物介導的RNAi技術提高小麥抗曬性 的應用研究，從而為曬蟲的防治和殺滅提供了全新的且安全有效的途徑。
【附圖說明】
[0019] 圖1曬蟲莖因和做7前PCR擴增結果； 圖中Μ:100bpmarker;1 :份巧2 :麥長管曬。
【具體實施方式】
[0020] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所 用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可市購。
[0021] 下述實施例中所用曬蟲為麥長管曬，由中國農業科學院植物保護研究所提供， 飼養曬蟲的小麥品種為科農199,將曬蟲接種到小麥幼苗上，放入人工氣候箱中（溫度 (20 + 2) °C，濕度60%~80%，光周期L:D=16 : 8)進行繁殖。
[0022] 1631化GFP質粒："倪志勇，徐兆師，劉麗，李連城，柴巖，陳明，馬有志.小麥轉錄 因子TaDREB6基因的克隆及鑒定.麥類作物學報，2008，28:357-363"，公眾可從南陽師范 學院生命科學與技術學院獲得。
[0023]質粒提取試劑盒購自Biomega公司，內切酶化細I、仍oRV及HiscribeT7體外 轉錄試劑盒購自肥B公司，大腸桿菌菌株D冊α、反轉錄試劑盒購自北京全式金公司，巧aq DNA聚合酶購自TaKaRa公司，Mi址lutePCRCleaningKit、Mi址luteGelExtraction Kit、RNACleaningKit購自Qiagen公司，各種氨基酸及其它試劑均購自北京拜爾迪公司。
[0024] 實施例1曬蟲基因的dsRNA的獲得 (1)麥長管曬總RNA的提取和cDNA的合成 分別取約20頭麥長管曬，按照北京全式金公司的Trizol試劑盒說明書提取總RNA，用RNACleaningKit進行純化，反轉錄合成cDNA第一鏈，操作步驟均參考試劑盒說明書。
[0025] (2)引物設計與基因克隆 利用PrimerPrime巧.0軟件設計引物P1-F和P1-R，由北京華大基因公司合成。綠色 巧光蛋白基因（做巧片段從南陽師范學院生命科學與技術學院實驗室保存的1631化GFP質 粒上擴增，利用PrimerPrime巧.0軟件設計引物P2-F和P2-R。
[0026]P1-F: 5 ' -TAATACGACTCACTATAGGGCAACAGTCAGCGGAAGTAC-3，（下劃線后的序列為 沈QIDNo:2的第1~19位）； P1-R:5'-TAATACGACTCACTATAGGGGTCAACATAACGCCCAAC-3'(下劃線后的序列為沈QID No:2的第225~242位的反向互補序列）。
[0027] P2-F:5' -TAATACGACTCACTATAGGGTGAAGTCAAGTTTGAAGGTG-3'(下劃線后的序列為 SEQIDNo:4 的第 1 ~20 位）； P2-R:5' -TAATACGACTCACTATAGGGTTTTGTTGATAATGGTCTGC-3^ (下劃線后的序列為沈Q IDNo:4的第206~225位的反向互補序列）。
[0028] 各引物序列中下劃線處為Τ7RNA聚合酶啟動子序列。 PCR反應體系為：5XPCRBuffer 10 yLdNTP (2. 5 mmol*Li)4 yLPfu 0. 5正向引物（10 ymol?Li)l yL、反向引物（10 μηιο1·??)1 yL、cDNA/做7損粒1 yL， 用(1地2〇補足至50 yL。
[0029] ?0?的反應程序為：941：3111111;941：3〇3,52°(：或551：3〇3,721：3〇3,35個循 環；72°C10min;4°C保存。（P1-F/P1-R的退火溫度為52°C;P2-F/P2-R的退火溫度為55°C) W麥長管曬的cDNA為模板，用P1-F/P1-R作為引物進行擴增，得到282 bp PCR產物(含40 bp的T7啟動子序列)，經過測序，該282 bp PCR產物除去兩端T7 RNA聚合酶啟動子序 列外的序列為SEQ ID No:2(可人工合成)。
[0030] W 1631化GFP質粒為模板，用P2