山核桃miR166d在提前植物花期或植物分生組織發育中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及基因功能領域，更具體地設及山核桃miR166d在提前植物花期或植物 分生組織發育中的應用。
【背景技術】
[0002] MicroRNA(miRNA)是一類廣泛存在于動植物中，含有莖環結構的miRNA前體，經過 Dicer加工之后的一類非編碼的小RNA分子（18-25個核巧酸）。miRNA通過在轉錄水平或 者轉錄后水平對基因組上的祀基因抑制其翻譯或者切割祀基因來調控基因表達，在基因表 達中起負調控其祀基因作用。miRNA在植物從成花誘導到花器官特征屬性形成的整個花發 育過程均發揮著關鍵作用。
[0003] 山核桃（CaryacathayensisSarg.)屬胡桃科山核桃屬植物，雌雄同株，主要分布 于浙江西部地區W及安徽地區，是我國特有的名優干果和木本油料樹種，是山區農民脫貧 致富的重要途徑；然而，山核桃從種子播種到結果需要10余年的時間，從而較大程度抑制 了山核桃的產量，如何縮短童期促進早實是山核桃研究者亟待解決的難題。
[0004] miR166是一種廣泛存在于單子葉植物和雙子葉植物中的miRNA。在植物眾多 miRNA中，研究表明miR166通過調節其祀基因：同源異型域一亮氨酸拉鏈蛋白化omeodoma in-leucinezippe巧rotein，皿-Zip)，在植物對逆境脅迫的響應過程中發揮著重要作用。裝 襲首猜中過量表達miR166會造成植株根瘤和側根數目減少，維管系統發育異常。受干旱誘 導表達的miR166通過影響根的數量和維管組織，從而來調節植物的抗干旱能力。在缺水 脅迫下裝襲首猜根中miR166表達上調，且野生型裝襲首猜在缺水脅迫下的表型與過表達 miR166的轉基因的植株表型相似。干旱脅迫下野生二粒小麥和大麥根中的miR166均表達 下調，可能存在其他的未鑒定的祀基因。鹽脅迫下玉米的miR166表達下調。山核桃miR166 在植物開花或植物分生組織發育的作用未知。
【發明內容】
陽0化]本發明提供了山核桃miR166d在提前植物花期或植物分生組織發育中的應用。 陽006]山核桃miR166d在提前植物花期或植物分生組織發育中的應用，所述山核桃miR166d的堿基序列如沈QIDNO. 1所示。
[0007] 優選地，所述植物是擬南芥或煙草。
[0008] 優選地，所述植物是擬南芥。
[0009] 獲得山核桃miR166d轉基因植株的具體方法包括：將包含所述山核桃miR166d的 前體基因連接到載體上，通過農桿菌介導轉化到擬南芥、篩選、培養和獲得轉基因株系。 陽010] 由于山核桃成熟miR166d本身序列很短，只有2化P，而其前體序列相對較長，連接 到載體上，有利于轉化實現，優選地，所述前體基因的堿基序列如SEQIDNO. 2所示。
[0011] 本發明公開了山核桃miR166d在提前植物花期或植物分生組織發育中的應用。應 用山核桃miR166d，有望調控山核桃的花期和分生組織發育；更具體地，有望調控山核桃的 花期和分生組織上的表型，例如降低山核桃的高度，增加分支數。
【附圖說明】
[0012] 圖1為山核桃花芽的總RNA 陽01引 圖2為山核桃miR166d前體的中間載體菌液PCR檢測
[0014] 圖3為山核桃miR166d前體的表達載體菌液PCR檢測
[0015] 圖4為山核桃miR166d轉基因擬南芥植株的抗性篩選
[0016] 圖5為山核桃miR166d轉基因擬南芥的PCR檢測
[0017] 圖6為野生型、擬南芥miR166d突變體和山核桃miR166d轉基因擬南芥的葉片數 目統計
[0018] 圖7為觀察到的野生型、擬南芥miR166d突變體和山核桃miR166d轉基因擬南芥 的表型
【具體實施方式】
[0019] 1.材料
[0020] 1.1實驗材料
[0021] 山核桃花芽采自浙江省杭州市臨安板橋村，選取不同株山核桃樹進行采樣。樣 品采下后立即液氮保存，帶回實驗室并放置在-80°C冰箱保存待用。另外，購買擬南芥 miR166d轉基因的擬南芥突變體種子（購于美國ABRC)。
[0022] 1. 2實驗試劑與儀器 陽02引 DNA聚合酶、各種限制性內切酶、T4連接酶、Marker和TRIzol試劑均購自寶生物 工程（大連）有限公司；質粒提取試劑盒及DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程股份 有限公司。PCR儀為美國PE9700PCR儀，超凈工作臺購自蘇州誠凈凈化科技有限公司。 [0024] 1.3引物合成及測序
[00巧]引物合成及測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。 陽0%] 2.方法
[0027] 2. 1山核桃花芽總RNA的提取 陽02引采用改良CTAB巧rizol法提取花芽樣品總RNA，步驟如下：
[0029] (1)在10血離屯、管中加入3血65°C預熱的CTAB提取緩沖液（10%CTAB，10% PVP40，1.0MTris-HCl(抑 8.0),51 化C1，0.6M邸TA(p冊.0))，加入 200μΙβ-琉基乙醇；
[0030] 似取-70°C保存的花芽2g，放入液氮充分預冷的研鉢中，于液氮中充分研磨至百 色粉末；
[0031] (3)將白色粉末迅速轉入預熱的提取液中，立即充分振蕩混勻，65°C水浴30min， 期間振蕩3-4次；
[0032] (4)在混合物中加入等體積的25:24:1(酸性飽和酪：氯仿：異戊醇），約3ml。混 合均勻后14000巧m離屯、lOmin(常溫）；
[0033] (5)取上清轉入新的10ml離屯、管中，加入等體積的氯仿/異戊醇（24:1)上下顛倒 混勻，12000;rpm4°C離屯、lOmin后取上清；
[0034] (6)重復步驟4 一次，直至中間層消失；
[0035] (7)上清轉移至1.5血離屯、管中，加入等體積的異丙醇后放置于-20°C冰箱冷凍 30min。12000巧m4°C離屯、lOmin棄掉上清，沉淀加入65°C預熱好的SSTE400μL溶液至全 溶；
[0036] (8)溶液中加入1血TRIzol試劑，室溫靜置5min。再加入200μL氯仿搖勻，室溫 靜置 2-3min;
[0037] 巧）4°C12000巧m離屯、15min;
[0038] (10)吸取上清，加入等體積異丙醇，室溫靜置lOmin;
[0039] (11)4°C12000rpm離屯、lOmin，棄掉上清，肉眼可見RNA沉于管底；
[0040] (12)加入1血預冷的75%乙醇洗涂沉淀，溫和振蕩，800化pm4°C離屯、5min，棄掉上 清； 陽04U(蝴重復步驟11，并將沉淀真空干燥7-lOmin;加入適量DEPC水溶解沉淀，-80°C保存備用。
[0042] 2. 2cDNA合成
[0043] 使用TAKARA試劑盒PrimeScriptTMII1stStrandcDNASynthesisKit,詳細 內容如下： W44] (1)在經過DEPC處理過的PCR管中配置下列反應體系：
[0045]
[0046] (2) 65°C保溫5min，冰上迅速冷卻。（模板RNA變性）
[0047] (3)再次配置反應體系如下：
[0048]
W例 （4)緩慢搖勻。 陽化0] (5) 42°C反應 30-60min。
[0051] (6)95°C5min酶失活后，冰上冷卻。
[0052] 2. 3前體序列的引物設計
GCGTCGTTTCCGACCATAT-3'，克隆所需序列。
[0054] 2. 4PCR擴增反應
[0055] W山核桃cDNA為模板擴增，反應體系如下：
[0056]
[0057] PCR反應條件為：94°C預變性 5min，94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸Imin。 30個循環后，72°C延伸lOmin。PCR反應完成后4°C暫時保存，其中退火溫度可根據Tm值進 行調整。
[005引 2. 5瓊脂糖凝膠電泳檢測與膠回收
[0059] 將PCR反應產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為TAE(40mMTris-乙酸鹽， ImM邸TA)，核酸燃料為邸。紫外光檢測電泳結果并回收PCR產物。利用上海生工公司的DNA膠回收試劑盒進行膠回收，具體步驟如下： W60] (1)通過瓊脂糖凝膠電泳盡可能將目的DNA片段與其他片段分開，用干凈的手術 刀片將含有目的DNA的瓊脂糖凝膠塊切下，放入1. 5mL離屯、管中。每個膠塊盡量不要超過 400mg，否則將會導致溶膠不完全。另外切膠過程應盡可能快，從而減少DNA在紫外線中暴 露時間來降低對DNA的損傷。 陽〇6U 似根據膠塊的質量和濃度，每lOOmg瓊脂糖加300~600μL的比例加入Buffer B2〇
[0062] (3)置于55°C金屬浴lOmin，期間混勻2~3次直至膠塊完全溶化為止。 陽06引（4)當目的片段<500bp時，可加入1/3體積的BufferB2的異丙醇，混勻。若 >5(K)bp，則此步驟可W省略。
[0064] (5)將溶化好的溶液全部移入吸附柱，8,OOOxg離屯、30sec。倒掉收集管中的液體， 并將吸附柱放入同一個收集管中。 陽0化](6)加入500μLWashSolution, 9000xg離屯、30sec。再次倒掉收集管中的液體。
[0066] (7)重復一次步驟6。
[0067] (8)將帶有收集管的吸附柱放入離屯、機，9000xg空離Imin。扔掉收集管，并將吸附 柱置于滅過菌的1.5mLEP管中。 W側 （9)打開吸附柱的蓋