RNAi干擾片段、干擾載體、制備方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物技術領域，具體設及一種RNAi干擾片段、RNAi干擾載體、及RNAi 干擾載體的制備方法及其應用。
【背景技術】
[0002] 在自然條件下，幾乎所有哺乳動物的性別比例都接近1: 1，從而實現了無間斷地進 行穩定地繁衍后代，在自然的條件下達到生態平衡。對于畜牧生產實際而言，理想的性別比 例具有十分重要的意義。利用泌乳、產蛋性狀進行生產的生產企業希望得到更多的雌性個 體，而產肉、產毛性狀的在雄性個體上表現得優勢性更加明顯。一直W來，人類對控制動物 后代的性別就有著極大的興趣。目前性別控制主要從受精前和受精后兩個方面進行，前者 應用精子分離后再進行受精，使得在受精時就決定了后代的性別；后者采用早期胚胎性別 鑒定，進行胚胎的性別篩選的方法來控制后代的性別。
[0003] 哺乳動物性別決定理論認為，性染色體為"XX"的受精卵就能夠發育成雌性個體， 而性染色體為"XY"的就會發育成雄性。那么從根本上講，控制家畜性別最理想的方法是 先分離X、Y精子，然后再進行受精，就能人為地控制后代的性別，理論上運是在性別控制中 最簡單、最經濟的途徑。自20世紀50年代后，關于精子分離的研究報告很多，運些研究都 試圖利用X精子和Y精子不同的物理特性（體積、密度、電荷、運動性）），采用離屯、法、電泳 法、離子交換法、細胞表面抗原法等不同的方法來實現精子的分離，但是都有一個共同的問 題一一可重復性差。而且運些差異隨著環境條件的不同而發生變化，因此，許多研究結果常 常不一致，甚至出現相反的結論，致使兩類精子某些差異性研究存在爭議。到目前為止，除 了Χ、Υ精子DNA含量具有差異可W肯定之外，其他方面的差異表現很小，甚至難W確定。但 是隨著分子生物學技術的不斷發展，W及研究工作的繼續深入，新的研究成果將會不斷涌 現。
[0004] 目前根據哺乳動物X、Υ精子DNA含量存在差異的原理，利用流動細胞檢索儀進行 分離X、Υ精子，分離效果最好，純度可達90%W上，但是由于設備昂貴，分離速度慢，用于 受精的精子數量少、活力差等原因，遠遠不能滿足生產上對性控精液的大量需求。相比之 下，如果能夠找到兩種精子發育或受精過程中，甚至胚胎發育時關鍵性的X、Υ染色體特異 mRNA，結合當代新興的分子生物學技術利用RNA干擾（RNAInterference,RNAi)的方法則 有望W較低的成本，簡便、快速地實現對動物的性別控制。 陽0化]RNAi是一種轉錄后的基因沉默（Post-transcriptionalGeneSilencing,PTG巧 現象，通過體外人工合成或體內產生的雙鏈RNA(DiAble-strandedRNA.dsRNA)在細胞內特 異性地降解其同源的mRNA，使得相應的基因干擾，實現阻止目標基因的表達。RNAi方法能 夠快速、簡便、有效、特異地下調細胞中的基因表達，它不但是研究基因功能的一種有力工 具，而且也為特異性基因治療提供了新的技術手段，其應用前景十分廣闊。
[0006] 在基因組、mRNA和蛋白水平的研究都證明，Χ、Υ精子基因表達的確存在差異。基因 表達檢測研究表明，在精子形成的減數分裂粗線期，為防止一些酶類與性染色體發生作用， 兩條性染色體高度濃縮形成性體。性體的形成保護了性染色體，性染色體上特殊基因的表 達被關閉。因此，哺乳動物成熟精子中沒有mRNA的轉錄，然而哺乳動物成熟精子中卻含有 mRNA，運種差異來自精子發生過程中的轉錄，其翻譯遠落后于轉錄。運些mRNA是精子成熟 后指導合成一些必須的蛋白，或者是受精后對卵母細胞mRNA庫的補充，或作為RNAi對生育 和胎兒生長發育起著關鍵的作用。
[0007]Hen化化sen等對小鼠的研究發現，減數分裂過程中，除Xist基因表達外，幾乎所 有的性染色體基因都沒有表達，然而減數分裂后期，一些性染色體特異基因開始表達。減數 分裂后，檢測到Y染色體上化ely和S巧基因具有較高的mRNA水平；在X精子中也檢測到 化elx基因mRNA高水平表達，同時發現X染色體特異基因Μ虹6A的表達產物。另外還有人 發現X、Υ染色體其他特異基因的表達，如X染色體特異基因Akap82 (精子尾部的骨架蛋白） 及Nap-X(編碼一種核相關蛋白），Y染色體特異基因Zfy-1、Zfy-2及Y353/B。
[0008] 其中Zfx/Zfy基因是染色體上編碼鋒指蛋白的一對等位基因，從減數分裂期開始 表達，在圓形精子細胞中的含量最高。Zfx基因是ZFY(zincfinger-Y)基因家族中的一 員，ZFY家族包括Zfx，Zfy和Z化基因，他們在分子結構上非常相似。一般哺乳動物有Zfx 和Zfy基因，Zfx基因位于X性染色體上，是雌、雄性哺乳動物X染色體必含的基因，Zfy 基因位于Y性染色體上，兩個基因位于性染色體的末端，但并不位于同源區域。Zfx基因包 括一個酸性的轉錄激動區域，一個核定位序列和一個DNA連接區，具有13個C2肥[切S(2) His(2)]型鋒指結構。在哺乳動物細胞中，C2肥鋒指結構是最常見的蛋白質結構之一。目 前已發現800多種具有運種鋒指結構的蛋白質，具有重要的生理功能。Zfx/Zfy編碼的蛋 白作為轉錄因子，在精子形成過程中具有一些功能并與精子的發生有關。
【發明內容】
[0009] 有鑒于此，本發明實施例提供一種RNAi干擾片段、干擾載體、制備方法及應用。主 要目的是通過RNAi干擾載體對動物Y染色體上的Zfy基因進行干擾，使得Zfy基因表達量 下降，W此達到人為控制動物性別的目的。
[0010] 為達到上述目的，本發明主要提供如下技術方案：
[0011] 一種RNAi干擾片段，用于干擾動物Y染色體上的Zfy基因，所述RNAi干擾片段序 列為沈QIDNO. 1或沈QIDNO. 2所示；
[0012] 所述Zfy基因負責編碼的蛋白作為轉錄因子，與精子的發生有關。
[0013] 另一方面，上述的RNAi干擾片段作為制備干擾動物Y精子基因的藥物的應用。
[0014] 另一方面，一種RNAi干擾載體，用于干擾動物Y精子基因，其特征在于，所述RNAi 干擾載體克隆有RNAi干擾片段，所述RNAi干擾片段的序列為SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2 所示。
[0015] 進一步的，所述RNAi干擾載體包括pLentiLox3. 7載體，所述pLentiLox3. 7載體 與所述RNAi干擾片段連接。
[0016] 另一方面，所述RNAi干擾載體在在動物受精前進行性別控制中應用。
[0017] 進一步的，所述RNAi干擾載體W睪丸直接注射的方式注射至動物體內，用于干擾 動物Y染色體上的Zfy基因。
[0018] 一種RNAi干擾載體的制備方法，包括如下步驟：
[0019] (1)酶切pLentiLox3. 7 載體；
[0020] (2)將所述RNAi干擾片段與酶切后的所述pLentiLox3. 7載體連接，得到連接產 物；
[0021] 其中，所述RNAi干擾片段序列為沈QIDNO. 1或沈QIDNO. 2所示；
[0022] (3)將所述連接產物轉化至感受態細胞中，篩選并將得到的菌液進行測序鑒定，并 將測序結果與所述RNAi干擾片段序列完全一致的菌液進行擴增；
[0023] 所述酶切位點為化al和化oil;所述發夾結構序列為SEQIDNO. 3或SEQIDNO. 4 所示；
[0024] (4)從所述擴增的菌液中提取RNAi干擾載體。 陽0巧]進一步的，所述的感受態細胞為pLentiLox3. 7載體細胞。 陽0%] 進一步的，所述篩選為W含有pLentiLox3. 7載體、酶切位點和發夾結構來進行篩 選。與現有技術相比，本發明至少具有下列優點：
[0027] 本發明提供的的RNAi干擾片段，通過對雄性綿羊的生殖細胞Y精子中的Zfy基因 進行沉默，阻礙、損傷或者破壞Y精子的正常發育和功能。在與雌性綿羊交配時給予了X精 子更多的受精機會，在受精前有效的控制了綿羊的性別從而使子一代綿羊產生的母羊比率 大大升高。本方法對所需精子細胞不會造成損傷或者降低其活力，而且成本低廉。
【附圖說明】
[0028] 圖1為本發明RNAi干擾片段、干擾載體、制備方法及其應用中ZfymRNA在細胞中 的表達水平。
[0029] 圖2為本發明RNAi干擾片段、干擾載體、制備方法及其應用中RNA干擾綿羊Zfy 子一代雌黑率。
[0030] 圖中:各組跟對照組比較，無上標的為差異不顯著；表示差異顯著（P<0. 05)。 [00川圖3為本發明RNAi干擾片段、干擾載體、制備方法及其應用中的載體構建示意圖。
【具體實施方式】
[0032] 為更進一步闡述本發明為達成預定發明目的所采用的技術手段及功效，結合較佳 實施例詳細說明如下。 陽〇3引實施例1
[0034] 設計并合成用于干擾動物睪丸生精細胞中的Zfy基因的RNAi干擾片段。下面本 實施例W綿羊睪丸生精細胞中的Zfy基因的RNAi干擾片段為例，對本發明提供的技術方案 進行說明。具體如下：
[0035] 根據綿羊Zfy基因的mRNA序列設計8個siRNA片段模板并篩選出兩個siRNA片 段，其中表1為用于siRNA的ZfycDNA模板；
[0036] 表 1用于siRNA的ZfycDNA模板
[0037]
[0039] 然后按照所述pLentiLox3. 7載體及所帶啟動子的要求，合成兩對shRNAi的寡聚 核巧酸序列。該兩對shRNAi干擾片段分別為shRNAA和shRNAG，如表2所示。 W40] 所使用的Zfy基因序列來自于NCBI基因庫，根據RNAi設計原則和在NCBI上的