一種用于hla基因分型的試劑盒和方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種試劑盒和方法，具體設及一種用于HLA基因分型的試劑盒和方 法。
【背景技術】
[0002] 現已有PCR擴增聯合Sanger測序對HLA基因進行分型的方法。W HLA-B基因分 型為例，該方法的實現方案：首先，設計特異性引物擴增HLA-B基因的2號和3號外顯子，為 了避免引物的偏倚性，一般會設計多對引物。其次利用sanger測序技術對PCR產物進行測 序，獲得含有雙等位基因信息的測序結果。再者通過公司專用的軟件（技術參數保密）對 數據進行分析，從而獲取樣本的HLA-B分型結果，分辨率4-6位不等。
[000引上述技術的缺點有下面幾點（W HLA-B基因分型為例）：1、PCR特異性引物方面： 現有的引物設計比較繁雜，需要多對引物進行擴增單一外顯子，成本高，增加實驗的復雜 度。2、分型準確率方面：只依賴2、3號外顯子序列信息進行分型，分型結果分辨率低。3.數 據分析：公司的分型軟件技術參數保密，不能夠對其采取的策略進行評價和優化。
[0004] 導致上述缺點的原因：1、設計多對引物進行PCR擴增目的片段，是因為設計者未 充分利用lOOOgenome和UCSC網站上snp數據庫的信息，設計無偏倚性擴增的引物。2、只 依賴2、3號外顯子序列信息進行分型，是因為設計者沒有考慮周全，忽視了HLA-B基因其他 外顯子也會影響分型結果。3、數據分析技術參數保密，是因為公司需要通過該軟件進行營 利運轉，我們無法獲取技術參數，因此也沒有辦法去評價。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于克服現有技術存在的不足之處而提供了一種用于HLA基因分 型的試劑盒，本發明還提供了一種HLA基因分型的方法。
[0006] 為實現上述目的，所采取的技術方案：一種用于HLA基因分型的試劑盒，所述試劑 盒包括用于擴增HLA-B基因的2號外顯子和3號外顯子的引物，和用于擴增HLA-B基因的 4號外顯子的引物；
[0007] 所述用于擴增HLA-B基因的2號外顯子和3號外顯子的引物包括由SEQ ID NO. 1 和SEQ ID NO. 2所示的引物序列組成的擴增引物對；
[000引所述用于擴增HLA-B基因的4號外顯子的引物包括由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示的引物序列組成的擴增引物對。
[0009] 本發明還提供了一種HLA基因分型的方法，所述方法包括：
[0010] (1)提取待測樣本的DNA;
[0011] 似分別采用由SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的引物序列組成的擴增引物對 和由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示的引物序列組成的擴增引物對，對待測樣本DNA進 行PCR擴增，得到含有HLA-B基因的2號外顯子和3號外顯子的第一擴增片段和含有HLA-B 基因的4號外顯子的第二擴增片段，然后分別純化含有HLA-B基因的2號外顯子和3號外 顯子的第一擴增片段和含有HLA-B基因的4號外顯子的第二擴增片段；
[0012] (3)將步驟（2)純化后的第一擴增片段和第二擴增片段分別進行測序；
[001引 （4)將步驟（3)中的測序結果與數據庫中HLA基因的外顯子標準序列進行對比，確 定HLA基因的型別。
[0014] 優選地，所述步驟（4)中數據庫為國際組織IMGT數據庫。
[0015] 優選地，如果比對后出現模棱兩可的分型結果，則將步驟（2)中的第一擴增片段 和第二擴增片段分別進行T-A克隆，然后進行測序比對，確定HLA基因的型別。
[0016] 優選地，如果比對后出現模棱兩可的分型結果，則針對步驟（2)中的第一擴增片 段和第二擴增片段分別設計allele特異性的引物進行區分，然后進行擴增后測序比對，確 定HLA基因的型別。
[0017] 本發明的有益效果在于：本發明提供了一種用于HLA基因分型的試劑盒和一種 HLA基因分型的方法，與現有技術相比，其優勢：
[0018] (l)PCR特異性引物方面：現有的引物設計比較繁雜，需要多對引物進行擴增單一 外顯子，成本高。針對每一個外顯子本發明最多只需一對引物就可W成功擴增出無偏倚性 的目的片段。
[0019] 似分型準確率方面：本發明聯合2、3、4外顯子（必要時加入1和5號外顯子）的 等位基因信息進行分型，與現有的只依賴2、3號外顯子進行分析，分型更加準確，分辨率更 局。
[0020] (3)數據分析：本發明采用腳本從sanger測序結果中獲取等位基因信息，聯合 使用2、3、4號外顯子等位基因信息和IMGT/HLA數據庫中4007條參考序列（最新版本號 3.22.0)兩兩組合后的數據信息，將兩者進行比對，找到對應樣本的HLA-B傳統分型結果， 分辨率有4-8位不等。
[0021] (4)后期處理：對一些依然模棱兩可的分型結果，進一步通過T-A克隆或者設計等 位基因特異性引物加W區分，從而保證分型結果的準確性和高分辨率。
[0022] 采用本發明的分型方法和試劑盒能夠使分型流程更加簡單，在降低成本的同時增 加分型分辨率和準確率，從而進一步應用到科研和臨床工作中去。
【附圖說明】
[0023] 圖1為本發明所述實施例1中分型結果；
[0024] 圖2為本發明所述實施例2中擴增HLA-B的2、3、4號外顯子的電泳圖；
[00巧]圖3為本發明所述實施例2中的測序峰圖。
【具體實施方式】
[0026] 為更好的說明本發明的目的、技術方案和優點，下面將結合具體實施例對本發明 作進一步說明。
[0027] 實施例1
[002引本實施例WHLA-B基因分型為例，進行HLA基因分型。
[0029] 一、樣本DNA的準備：
[0030]抽取 2ml全血，用試劑盒QIAampDNAMiniKitCat.No. 51304 抽提DNA，A260/280 二1· 7~2· Oo
[0031] 二、擴增HLA-B的2、3、4號外顯子：
[0032] 1、擴增2號和3號外顯子的引物序列：
[0033] F1:CGGGAGGGAAATGGCCTCTG(SEQ ID NO. 1)
[0034] R1: TTCAACGGAGGGCGACATTCTA (沈Q ID NO. 2)
[0035] 2、擴增4號外顯子的引物序列：
[0036] F2: TGTCCTGTCCATTCTCAGGC (沈Q ID NO. 3)
[0037] R2: TTCCCTGAGAAGAGATATGACCC (沈Q ID NO. 4)
[0038] 3、PCR反應體系和條件：
[00測（1)反應體系：使用高保真DM聚合酶PrimisSTAR/.咬GXL DM Polymerase Cat. No. R050A;如下表1 :
[0040] 表1反應體系
[0041]
[004引似反應條件：
[0043]
[0044] 4、進行DNA電泳質檢目的條帶（片段大小符合預期、條帶單一、亮度適中）
[0045] 片段大小：擴增exon2和exonS的片段1長度為lOlSbp
[0046] 擴增exon4的片段2長度為409bp
[0047] S、sanger測序：對獲得的兩個PCR產物片段進行sanger測序。片段1雙向測序， 分別獲得ex〇n2和exon3的序列信息；片段2正向測序，獲得exon4的序列信息。公司會返 還油1格式的峰圖文件。
[0048] 四、應用HLA專業軟件進行分型：
[0049](一）將油1文件轉換為含有簡并形式的化sta序列文件：
[0050] 將exon2、3、4外顯子的序列從測序結果中截取出來，W下面的格式合并2、3、4號 外顯子的序列（/代表雙峰）：
[0051] >exon2
[0057](二）、將第（一）步中獲得的序列與HLA-B數據庫進行兩兩比對，從數據庫中獲取 與目的序列一樣的候選序列，再將候選序列兩兩組合獲取跟目的序列完全一致的組合。該 組合就是我們要的分型結果。
[005引1.如果可W成功分型，結果會W圖1的形式導出。
[005引2.輸出分型結果：上圖結果應為B*27:04:01 ;B*40:01。
[0060] 五、結果分析：
[0061] 1、如果結果文件為空，說明我們一開始輸入的簡并形式序列有錯誤（原因可能是 測序質量不好，有些雙峰不能清晰地辨別），運種情況需要返回最初去修改含有簡并形式的 fasta序列文件。
[0062] 2、如果獲得的分型中含有ambiguity,我們可W做T-A克隆或者設計allele特異 性的引物進行區分。