黃瓜雌性性狀相關的SNP標記與InDel標記及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及黃瓜雌性性狀相關的SNP標記與InDel標記及其應用，屬于分子生物 學技術領域。
【背景技術】
[0002] 黃瓜是我國栽培面積最大的蔬菜作物之一。利用雌性系育成的黃瓜雜交種具有早 熟、豐產的特點。另外，利用雌性系配制一代雜種，可大大降低制種成本，提高制種的純度。 但是，由于我國缺乏相應的雌性系種質資源，利用常規育種手段把國外雌性源回交轉育成 國內密刺黃瓜類型和華南型黃瓜類型的雌性系，育種周期長，費工費時。而且，黃瓜性型的 表達還受到環境條件的影響，依靠人工進行表型選擇還存在不夠準確的問題。運些問題的 存在，使得黃瓜雌性系的選育進展緩慢，影響了黃瓜雌性系育種的進程。而基于基因型選擇 的現代分子標記輔助育種技術，可W大大提高性狀選擇的效率，加速育種進程。
[0003] 近年來研究發現，乙締合成基因是黃瓜性別決定的關鍵基因。黃瓜的乙締合成酶 基因ACS1和ACS2分別是決定黃瓜性別分化的F基因和Μ基因。另外，研究還發現黃瓜性 別表達與乙締信號應答基因如受體基因ETR1、ΕΙΝ3等的表達相關。因此，從與黃瓜雌性表 達相關的關鍵基因入手，篩選用于黃瓜性型鑒別的分子標記，輔助黃瓜雌性系育種具有重 要意義。
[0004] 單核巧酸多態性（singlenulceotidepolymo;rphism,SNP)是繼限制性片段 長度多態性RFLP、擴增片段長度多態性AFLP和微衛星標記SSR之后的新一代分子標 記。它具有分布廣、密度高、多態性豐富等特點，而且能直接反應植物基因水平上的差異。 InDel(insertion-deletion)插入缺失標記，指的是兩種親本在全基因組中的差異，相對另 一個親本而言，其中一個親本的基因組中有一定數量的核巧酸插入或缺失。本發明是在黃 瓜雌性系及其近等基因系重測序的基礎上，開發用于黃瓜雌性系選擇的SNP^nDel分子標 記。前人的研究認為，通過黃瓜基因組中ACS1拷貝數的分析，即可判斷雌性與否，但也有研 究結果與此相惇。 陽0化]因此，開發新的黃瓜雌性系分子標記，對于鑒定不同來源的雌性系材料和黃瓜雌 性系的輔助選擇具有重要意義。
【發明內容】
[0006] 本發明針對現有技術的不足，提供黃瓜雌性性狀相關的SNP標記與InDel標記及 其應用。 陽007] 本發明技術方案如下：
[0008] 黃瓜雌性性狀相關的SNP標記與InDel標記，均位于6號染色體上編碼黃瓜乙締 合成酶基因ACSl/Csa6G496450的起始密碼子上游800~1300bp區間內；
[0009] SNP1位于6號染色體的24216638bp位置，非雌性系材料為A，純雌性材料為G;
[0010] SNP2位于6號染色體的24216699bp位置，非雌性系材料為G，純雌性材料為T;
[0011] SNP3位于6號染色體的24216739bp位置，非雌性系材料為Τ，純雌性材料為C;
[0012]SNP4位于6號染色體的24216776bp位置，非雌性系材料為T，純雌性材料為A;
[0013]SNP5位于6號染色體的24216813bp位置，非雌性系材料為C，純雌性材料為T;
[0014]SNP6位于6號染色體的24216843bp位置，非雌性系材料為CA，純雌性材料為TG;
[0015]SNP7位于6號染色體的24216848bp位置，非雌性系材料為G，純雌性材料為A;
[0016]SNP8位于6號染色體的24216875bp位置，非雌性系材料為T，純雌性材料為C;
[0017]SNP9位于6號染色體的24216958bp位置，非雌性系材料為T，純雌性材料為C; 陽01引InDell位于6號染色體的24216613bp位置，非雌性系材料為TGAGAATGTTGATAGAGGTTTT的缺失，純雌性材料為TGAGAATGTTGATAGAGGTTT的插入；
[0019]InDel2位于6號染色體的24216849bp位置，非雌性系材料為GG的插入，純雌性材 料為GG的缺失；
[0020]InDel3位于6號染色體的24216973bp位置，非雌性系材料為T的插入，純雌性材 料為T的缺失；
[0021] InDel4位于6號染色體的24217018bp位置，非雌性系材料為TAATGG或者TGATGA 的插入，純雌性材料為TAATGG或者TGATGA的缺失。
[0022] 檢測上述SNP標記與InDel標記的檢測引物，檢測引物為一對，上游引物核巧酸序 列如SEQIDNO. 1所示，下游引物核巧酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0023] 上述SNP標記與InDel標記在黃瓜雌性系品種鑒定中的應用。
[0024] 上述應用，步驟如下： 陽0巧](1)提取待測黃瓜基因組的DNA;
[0026] 似W待測黃瓜的基因組DNA為模板，利用SNP標記與InDel標記的檢測引物進行 PCR擴增反應；
[0027](3)檢測擴增產物，根據SNP標記或InDel標記判斷待鑒定品種為純雌性材料或非 雌性系材料。
[0028] 根據本發明優選的，所述步驟似中，PCR擴增反應的反應體系為251μ1，具體如 下：
[0029]lOng/μ1 模板DNA1μ1，lOpmol/μ1 上游引物 1μ1，lOpmol/μ1 下游引物 1μ1， lOmmoVldNTRiiix0. 5μ1，TaqDNA聚合酶lU，lOXPCR反應緩沖液 2. 5μ1，余量為超純水。
[0030] 根據本發明優選的，所述步驟（2)中，PCR擴增反應的擴增程序為：
[0031]先進行梯度降落PCR，95°C變性30s，退火溫度從65°C降到56°C，每循環降退火溫 度1°(：，453,72°(：延伸1111111;
[0032] 然后95°(：變性3〇3,56°(：退火453,72°(：延伸1111111，20個循環；最后72°(：延伸 10min〇
[0033] 上述與黃瓜雌性相關的SNP標記與InDel標記在黃瓜分子標記輔助育種中的應 用。
[0034] 有益效果
[0035]1、本發明首次發現位于編碼黃瓜乙締合成酶基因ACSl/Csa6G496450的起始密碼 子上游800~1300b區間處存在9個與黃瓜雌性相關的SNP標記（SNP1~SNP9)和4個 InDel標記（InDel1~InDel4)，通過任一SNP標記或InDel標記均可W鑒別出黃瓜雌性與 否。
[0036] 2、本發明所述鑒定方法可替代傳統的W表型觀察判斷的方法，可W在黃瓜苗期和 室內進行，比在田間開花坐果期人工觀察便捷，可用于大規模篩選育種材料，節約±地和成 本，大大加速黃瓜育種進程，使結果更加準確可靠。
[0037] 3、本發明通過基因組重測序分析，在黃瓜ACS1基因的上游序列中發現多個雌性 相關SNP和InDel位點，并通過一對引物的擴增就可得到運些變異位點的序列信息，而且通 過驗證發現在不同雌性源材料中分析結果一致。因而，本發明能夠很好的鑒定不同來源的 雌性系材料，能夠用于不同來源的雌性系材料的輔助選擇。
【附圖說明】
[003引圖1黃瓜雌性和非雌性系基因組DNA電泳檢測圖；
[0039]圖中：1，AZ-1 ;2, BB ;3, X8-2 ;4, AlOh ;5, A8化；6, M16 ;7,YN;8, A72 ;9, ZQ3 ;10， SJ11 ;11，MC8-3 ;12, Cuilong ;13, BM28 ;14, DL102。
[0040] 圖2黃瓜雌性和非雌性系PCR產物電泳圖：
[0041 ] 圖中：所用分子marker為化2000,共有6個條帶，大小依次為2000bp, 100化P, 75 化P, 5(K)bp，25化P,l(K)bp，擴增產物對應的條帶為75化P。 陽0創圖3實施例1中黃瓜雌性和非雌性材料PCR擴增序列比對及SNP標記、InDel標 記。
[0043] 圖中：M16、日本黃瓜類型的雌性源材料；BB、白黃瓜，華南類型非雌性系；AZ-1、 華北型非雌性系；X8-2為華北型的新泰密刺，非雌性系；MC8-3、X8-2回交轉育的雌性 系；A86h、AZ-1回交轉育的雌性系；AlOh、BB回交轉育的雌性系；A72、密刺類型的雌性系； SJ11、歐美水果黃瓜類型的雌性系；ZQ3、歐美加工型黃瓜雌性系；YN、華南類型黃瓜雌性 系；化ilong、華南類型黃瓜雜交種，為青島農科院品種；DL102、華北類型雜交種，山東農科 院品種；BM28、華北類型雜交種，天津德瑞特種業有限公司。
[0044] 圖4實施例2中黃瓜雌性和非雌性材料PCR擴增序列比對及SNP標記、InDel標 記。
[0045] 圖中：Zhongnong26為華北類型雜交種；Qingyan2,華南型雜交種；Jinchun2,密刺 類型雜交種Jinyou35,密刺類型雜交種。
[0046] 圖5實施例1所述為X8-2開花期照片，為田間觀察結果；
[0047] 照片顯示雄花多于雌花，證明樣品為非雌性材料；
[0048] 圖6實施例1所述為雌性源M16開花期照片，為田間觀察結果；
[0049] 照片顯示該植株節節著生雌花，證明樣品為純雌性材料。
【具體實施方式】
[0050] 下面結合實施例對本發明的技術方案做進一步闡述，但本發明所保護范圍不限于 此。
[0051] 檢測品種來源：
[0052] M16、日本黃瓜類型的雌性源材料，來源于國家種質庫；
[005引 BB、白黃瓜，華南類型，來源于山東海陽地方品種；
[0054] AZ-1、華北型，來源于山東地方品種； 陽化5] X8-2、華北類型，來源于新泰密刺黃瓜；
[0056]MC8-3、X8-2回交轉育的雌性系；
[0057] A86KAZ-1回交轉育的雌性系； 陽化引A10h、BB回交轉育的雌性系；
[0059] A72、密刺類型的雌性系，來源于山東農科院蔬菜花弁研究所；
[0060] SJ11、歐美水果黃瓜類型的雌性系，來源于波蘭農科院；
[0061] ZQ3、歐美加工型黃瓜雌性系，來源于德瑞特種業有限公司；
[0062]YN、華南類型黃瓜雌性系，來源于山東農科院蔬菜花弁研究所；
[0063] 化ilong、華南類型黃瓜雜交種，來源于青島農科院；
[0064] 化102、華北類型雜交種，來源于山東農科院； 陽0化]BM28、華北類型雜交種，來源于天津德瑞特種業有限公司；
[0066] Zhon即ong26、華北類型雜交種，來源于中國農科院； 陽067] Qingyan2、華南型雜交種，來源于青島農科院；
[0068]Jinchun2、天津黃瓜研究所密刺類型雜交種；
[0069]Jinyou35、天津黃瓜研究所密刺類型雜交種。
[0070] 上述品種均為現有已知品種。 陽0川 實施例1
[0072] 2014、2015兩年夏季分別種植純雌系材料8個（410}1，48化-1，]\116,472,293,5111， MC8-3,YN)、非雌性材料 3 個（AZ-1，BB，X8-2)及雜交種 3 個（Cuilong，BM28,DL102)，取性 型穩定的純雌性材料和非雌性材料及雜交種的幼嫩葉片進行DNA提取，然后進行PCR擴增 和分子標記檢測分