一種抗Och1單克隆抗體的制備與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫學生物工程技術領域，具體涉及一種抗Ochl單克隆抗體，W及該單 克隆抗體在用于抗白念珠菌感染中的應用。
【背景技術】
[0002] 0CH1是編碼細胞壁α-1，6-甘露糖轉移酶的基因，缺失可阻斷對糖蛋白的過度糖 基化，是白念珠菌毒力所必須的，真菌的特異性基因。因此，Ochl蛋白是一個很有前景的基 于抗體治療的抗真菌祀標。
[0003]目前尚無有關抗Ochl單克隆抗體的文獻報道，也無抗Ochl單克隆抗體用于抗侵 襲性念珠菌的感染的文獻報道。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種抗白念珠菌細胞壁蛋白Ochl單克隆抗體、用于制備 該單克隆抗體的多膚、分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株，W及該單克隆抗體的應用。
[0005] 本發明的第一方面，是提供一種用于制備抗白念珠菌細胞壁蛋白（Ochl)單克隆 抗體的多膚，其氨基酸序列如SEQIDNO: 1所示的。
[0006]DWKLFTGMEQ佛QIDN0:1)
[0007] 本發明的第二方面，是提供一種抗Ochl單克隆抗體，是由保藏編號為CCTCCNo: C201484的雜交瘤細胞株分泌產生。
[0008] 本發明的第Η方面，是提供一株雜交瘤細胞株，其保藏編號為CCTCCNo;C201484。
[0009] 本發明的第四方面，是提供一種抗Ochl單克隆抗體的制備方法，該方法的步驟如 下：
[0010] a)合成氨基酸序列如SEQIDNO;1所示的多膚；
[0011] b)將上述多膚導入表達載體，表達并純化，作為免疫原免疫小鼠；
[0012]C)取免疫鼠的脾細胞融合；
[0013]d)經多輪篩選出合成多膚反應陽性的細胞克隆，作為抗Ochl單克隆抗體的雜交 瘤細胞株CCTCCNo;C201484;
[0014]e)通過在小鼠體內接種雜交瘤細胞生產腹水抗體，將腹水進行純化，得到抗Ochl 單克隆抗體。
[0015] 本發明的第五方面，是提供上述的用于制備抗Ochl單克隆抗體的多膚在制備 WesternBlot或免疫組化檢測白念珠菌感染的試劑或試劑盒中的應用。
[0016]W及，上述的抗Ochl單克隆抗體在制備WesternBlot或免疫組化檢測白念珠菌 感染的試劑或試劑盒中的應用。
[0017]W及，上述的雜交瘤細胞株在制備WesternBlot或免疫組化檢測白念珠菌感染的 試劑或試劑盒中的應用。
[0018] 進一步地，本發明還提供了上述的用于制備抗Ochl單克隆抗體的多膚在制備預 防或治療白念珠菌感染藥物中的應用。
[0019] W及，上述的抗Ochl單克隆抗體在制備預防或治療白念珠菌感染藥物中的應用。
[0020] W及，上述的雜交瘤細胞株在制備預防治療白念珠菌感染藥物中的應用。
[0021] 本發明的具體技術方案如下：
[0022] 1.針對抗Ochl的編碼框氨基酸全序列（GENBANKID:3641751)設計并合成16個 多膚，序列分別為：
[0023]多膚 1 邸DGMPEMEQ(沈QIDN0:2)
[0024]多膚 2 PTSTHKTEYN(SEQIDN0:3)
[00巧]多膚 3VGID邸SFPK(沈QIDN0:4)
[0026]多膚 4 NQMGA邸甜D(SEQIDN0:5)
[0027] 多膚 5 ELELNSNWKE(SEQIDNO:6)
[0028]多膚 6KKWATIIDWK(SEQIDNO:7)
[0029]多膚 7 EQLYSQVPDV(SEQIDN0:8)
[0030]多膚 8 QTWEDKNPDY(SEQIDNO:9)
[0031]多膚 9 NSPKLQLAKE(SEQIDNO: 10)
[0032]多膚 10 DWKLFTGMEQ(沈QIDN0:1)
[0033]多膚 11 PNKKY化PDE(沈QIDN0:11)
[0034]多膚 12TRHKKGQLKK(SEQIDN0:12)
[0035]多膚 13 DESTLRQ化S(沈QIDN0:13)
[0036]多膚 14 DEWISNSEMI(沈QIDN0:14)
[0037] 多膚 15 KVLGKNEGGD(SEQIDN0:15)
[0038]多膚 16 QFPYDESKPF(沈QIDN0:16)
[0039] 將上述多膚分別導入表達載體。
[0040] 2.陽性克隆的鑒定，提取及表達菌轉化。
[0041] 3.大量誘導表達生產。
[0042] 4.Ni柱親和純化，經過純化，得到蛋白抗原用于免疫。
[004引 5.將成功獲得的抗原混合免疫鼠齡為8~12周的雌性BALB/c健康小鼠3只。采 取小鼠快速免疫方式，將3只小鼠的脾臟混合進行融合。
[0044] 6.經多輪篩選出反應陽性的細胞克隆，作為抗鼠抗Ochl蛋白單克隆抗體的雜交 瘤細胞株 5737-lRE-4M4/4N5_111218。
[0045]7.通過在小鼠體內接種雜交瘤細胞生產腹水抗體，將腹水進行純化，得到抗鼠抗 Ochl的單克隆抗體。
[0046] 本發明提供了抗Ochl的單克隆抗體，該單克隆抗體識別Ochl蛋白氨基酸序列 DWKLFTGMEQ。送條多膚是上述的16條多膚表達純化后免疫，最終選擇到的產生效價比較高 的抗體所針對的抗原表位。
[0047] 本發明的單克隆抗體的獲得采用了本技術領域常規的方法，即通過在小鼠體內接 種雜交瘤細胞并產生腹水抗體，取出腹水經純化而得到。
[0048] 本發明所制備的單克隆抗體是一種免疫球蛋白，可特異性結合白念珠菌的蛋白。
[0049] 本發明還提供了上述抗Ochl的單克隆抗體、雜交瘤細胞株在檢測白念珠菌中的 應用，具體是指在制備WesternBlot或免疫組化檢測試劑或試劑盒中的應用。本發明為抗Och1的臨床抗真菌感染免疫治療應用提供了新的思路。
【附圖說明】
[0050] 圖1是單克隆抗體WesternBlot檢測白念珠菌蛋白的圖。
[0051]圖2是免疫英光檢測圖，其中A是單克隆抗體免疫英光檢測與白念珠菌酵母態細 胞結合的圖；B是單克隆抗體免疫英光檢測與白念珠菌菌絲態結合的圖。
[0052] 圖3是用ELISA法檢測抗Ochl單抗與真菌活細胞及細胞壁蛋白及細胞質蛋白的 結合曲線圖
[0053] 圖4是白念珠菌WlXl〇5cells/鼠攻擊劑量下，給予不同劑量單克隆抗體的保護 作用圖。
[0054] 圖5是白念珠菌WIX105cells/鼠攻擊劑量下，給予Img/kg單克隆抗體兩次，對 系統性白念珠菌感染保護的圖。其中，A是小鼠存活率曲線；B是攻擊后第60天小鼠腎臟載 菌量。
[00巧]本發明的雜交瘤細胞株，命名為5737-lRE-4M4/4N5_111218,保藏于中國典型培養 物保藏中必（簡稱CCTCC)，保藏日期2014年6月17日，保藏編號CCTCCNo;C201484。
【具體實施方式】
[0056] 下面結合實施例和附圖對本發明進行詳細描述。但下列實施例不應看作對本發明 范圍的限制。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0057] 實施例1.抗Ochl的單克隆抗體的多膚序列選擇和多膚的制備 [005引多膚序列的選擇
[0059] Ochl有385個氨基酸，根據其氨基酸序列信息委巧艾比瑪特生物醫藥（上海）有 限公司設計、篩選并合成了多膚序列用于多膚合成；DWKLFTGMEQ
[0060] 實施例2.抗Ochl的單克隆抗體的制備和純化
[0061] 委巧艾比瑪特生物醫藥（上海