一株產抗菌蛋白基因工程菌株與應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程技術領域，涉及一株產抗菌蛋白基因及工程菌株與應用。
【背景技術】
[0002]隨著可持續農業的不斷發展以及化學農藥抗性和污染問題的日益嚴重，微生物農藥成為植物病害防治的重要手段。目前，廣泛應用的微生物農藥以活菌制劑為主，應用中存在儲藏期短和防效不穩定現象。研究發現一些生防菌能夠產生抗菌蛋白，但因產量低和穩定性差難以產業化。近年來，隨著分子生物學與生物技術的不斷發展，微生物農藥的研發由活菌制劑向重組微生物農藥方向發展。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是提供一株含有抗菌蛋白基因工程菌株與應用，該基因工程菌株具有抗菌蛋白誘導時間短，表達率、純化后產量和回收率高以及能夠抑制大豆根腐病菌和水稻惡苗病菌生長的特性。
[0004]生防菌株TF28具有廣譜抑菌活性，能夠產生多種抗菌蛋白，從TF28菌株發酵液中可以分離純化出一種分子量較小的抗菌蛋白API (10KD)，經N端測序得到N端氨基酸序列，在對該菌株進行基因組測序之后，發現了該抗菌蛋白的基因序列。因此，本發明采用人工合成方法合成該抗菌蛋白基因，連接到表達載體pET32a(+)上，轉化E.coli BL21菌株中，獲得一株高表達抗菌蛋白的基因工程菌株(pET32a(+)-Apl-BL21)，其為含抗菌蛋白的大腸桿菌(Escherichia coli)工程菌wswJW_86，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.11542，保藏日期為2015年10月21日，保藏地址為北京市朝陽區北辰路I號院3號。
[0005]上述高表達基因工程菌株(pET32a(+)-Apl_BL21)的構建方法如下:
[0006]將抗菌蛋白API基因和質粒pET32a (+)分別用BamH I和XhoI I雙酶切，用T4DNA連接酶連接后轉化E.coli BL21感受態細胞中，獲得帶有抗菌蛋白基因的工程菌株(pET32a(+)-Apl-BL21)。
[0007]本發明的基因工程菌株含有抗菌蛋白基因，在30°C誘導時間短，表達率高(43.2% )，純化蛋白產量高(124.82mg/L)，回收率高(92%)，經ITPG誘導、HIS柱純化和腸激酶酶切后的蛋白對植物病原菌(大豆根腐病菌Fusarium oxysporum、水稻惡苗病菌Fusarium moniIiforme)有很好的抑制作用，抑制率達80%以上，該菌株為重組蛋白農藥的研發提供了新型的菌株資源。
[0008]保藏信息:
[0009]分類命名:大腸桿菌(Escherichiacoli)；
[0010]保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；
[0011]保藏編號:CGMCCN0.11542 ；
[0012]保藏日期:2015年10月21日；
[0013]保藏地址:北京市朝陽區北辰路I號院3號。
【附圖說明】
[0014]圖1為表達載體pET32a(+)-Apl酶切后的電泳圖，圖中:1為D2000 DNAMarker (MD121221)，2 為 pET32a_APl 質粒 DNA，3 為 pET32a_APl 質粒 DNA 雙酶切；
[0015]圖2基因工程菌株誘導表達后的SDS-PAGE電泳圖，圖中:1為工程菌30 °C誘導2h的電泳圖，2為E.coli BL21菌株，3為蛋白質分子量標準(Lot#26616 ThermoScientific)，箭頭指向為表達蛋白；
[0016]圖3為菌體裂解、純化及腸激酶酶切后的SDS-PAGE電泳圖，圖中:I為腸激酶酶切純化后的重組蛋白，2為HIS柱純化后的重組蛋白，3為超聲裂解后的總蛋白，4為E.coliBL21 菌株，5 為蛋白質分子量標準(Lot#26616 Thermo Scientific)；
[0017]圖4為腸激酶酶切后的重組蛋白對大?根腐病囷的抑制結果，圖中:1為吸收1uL抗菌蛋白的濾紙片，2為吸收20uL抗菌蛋白的濾紙片，3為吸收1uL無菌水的濾紙片，4為吸收20uL無菌水的濾紙片；
[0018]圖5為腸激酶酶切后的重組蛋白對水稻惡苗病菌的抑菌效果圖，圖中:1為吸收1uL抗菌蛋白的濾紙片，2為吸收20uL抗菌蛋白的濾紙片，3為吸收1uL無菌水的濾紙片，4為吸收20uL無菌水的濾紙片。
【具體實施方式】
[0019]下面結合附圖對本發明的技術方案作進一步的說明，但并不局限于此，凡是對本發明技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，均應涵蓋在本發明的保護范圍中。
[0020]本發明提供了一株產抗菌蛋白基因工程菌株，包括以下內容:
[0021]—、抗菌蛋白基因合成及基因工程菌株的構建
[0022]依據菌株基因組序列人工合成抗菌蛋白基因，在基因5’端加上BamH I酶切位點，在3’端加上Xhol I酶切位點，合成的抗菌蛋白APl基因序列見SEQ ID N0.1。因該抗菌蛋白較小，為了提高基因表達率，選pET32a(+)作為表達載體。將人工合成的抗菌蛋白APl基因和質粒pET32a(+)分別用BamH I和XholI雙酶切，用T4DNA連接酶連接后轉化E.coliBL21感受態細胞中，獲得帶有抗菌蛋白基因的工程菌株(pET32a(+)-Apl-BL21)。
[0023]具體方法:
[0024]酶切:目的基因和質粒DNA分別用BamH I和Xho 11雙酶切。
[0025]取目的基因(5yg)或pET32a 質粒 DNA(1 yg)，加入 lOXTango? buffer (I μ I),BamH I (I μ I)，去離子水補足 10 μ 1，37°C酶切 3h 后，再加入 lOXTango? buffer (2 μ I),XholI (I μ I)，去離子水7 μ 1，37°C酶切3h，雙酶切后的基因和質粒用膠回收試劑盒純化，4 °C冰箱保存備用。
[0026]連接:取酶切后的基因40ng，質粒DNA 10ng, 10X連接buffer (I μ I)，T4DNA連接酶I μ I，用去離子水補足至?ο μ 1，20°C連接2h。
[0027]轉化:10 μ I連接液加到100 μ L BL21感受態細胞，輕彈混勻，冰浴30min后置于42°C恒溫90s，冰浴中放置3min，加入250 μ L 37°C預熱的LB培養基，37°C，150r/min震蕩培養45min。取菌液100 μ L涂布含100 μ g/mL的氨芐青霉素，240 μ g/mL IPTG和400 μ g/mL X-gal的LB固體瓊脂培養基上，37°C培養16h。
[0028]二、工程菌篩選鑒定
[0029]挑取白色菌落接種于5mL含氨芐青霉素的LB液體培養基中，37°C震蕩培養18h，用質粒提取試劑盒提取質粒DNA，用BamH I和Xhol I雙酶切質粒DNA進行鑒定，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，結果表明在321bp處有一條DNA片斷，說明已獲得含抗菌蛋白基因的工程菌株。
[0030]三、抗菌蛋白基因的表達
[0031]菌株活化后，按I %接種量轉接于含100 μ g/mL氨芐青霉素的10mL LB培養基中，30°C，160r/m振蕩培養，待OD600為0.8?1.0時，加入IPTG至終濃度為0.lmmol/L，30°C、160r/m的條件下誘導表達2h，以E.coli BL21菌株作對照。取1.0mL培養液置于1.5mL無菌離心管中離心2min，用20 μ L無菌水懸浮菌體，加入5X蛋白上樣緩沖液(碧云天生物技術有限公司，商品編號:P0015)，100°C煮5min，離心收集上清液，進行SDS-PAGE電泳(10%分離膠和5%濃縮膠)，上樣量為5 μ L，SOv電泳至樣品接近分離膠后，調節電壓為10v繼續進行電泳，直至溴酚藍到達分離膠底部，用卡馬斯亮藍染色1.5h，用脫色液脫色，結果如圖2所示，在27KDa處有一條明顯蛋白帶。
[0032]四、抗菌蛋白的分離純化及抑菌活性測定
[0033]I)抗菌蛋白的分離純化
[0034]取450mL誘