一種高芽孢率的巨大芽孢桿菌的發酵方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種高芽孢率的巨大芽孢桿菌的發酵方法，屬于微生物發酵工程技術領域。
【背景技術】
[0002]巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)為革蘭氏陽性菌，是一種植物根系促生細菌，也是微生物肥料中的常用菌種。巨大芽孢桿菌可以用來生產解磷解鉀固氮肥，具有降解土壤中不能被植物利用的磷和鉀的功效，將它施用到煙葉上對提高煙葉發酵增香的效果獨特。它既是生產微生物肥料的常用菌種，也是制作水體處理劑的常用菌種。巨大芽孢桿菌對農業生產有很多好處，因此在農業上具有廣闊的應用前景。芽孢主要是芽孢桿菌屬Bacillus與梭菌屬Clostridium中細菌產生的特殊休眠體，有極強的抗逆性，對多種不良條件有強耐受性。由于芽孢極強的抗逆性，使芽孢桿菌具有很好的應用前景，特別是在使用活菌制劑中表現出強大的生命力，是制備微生物菌劑的理想存在形式。
[0003]巨大芽孢桿菌也有產芽孢的特性，但是與解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌等容易形成芽孢的微生物菌株相比，還存在活菌量偏低、芽孢形成率不高、發酵周期偏長、生產成本高等問題。并且，芽孢的過早或者過晚生成會嚴重影響一些目的產物的生產和高濃度菌體的獲得。
【發明內容】
[0004]本發明針對現有微生物肥料常用的巨大芽孢桿菌發酵技術的不足，造成芽孢產率不尚的冋題，提供一種尚芽抱率的巨大芽抱桿菌發酵方法，以提尚廣品的芽抱含量，廣品質量和使用效果。
[0005]本發明的技術方案如下:
[0006]—種高芽孢率的巨大芽孢桿菌的發酵方法，包括以下步驟:
[0007](1)將巨大芽孢桿菌活化后，接種于固體培養基上，經34?37°C靜置培養2?3天，得二次活化后的巨大芽孢桿菌；
[0008](2)將步驟(1)制得的二次活化后的巨大芽孢桿菌接種于種子培養基中，在溫度34?37°C，溶氧值20?70mg/L，發酵培養14?20小時，制得種子菌液；
[0009]所述種子培養基按質量百分比，由如下組分組成:
[0010]蔗糖1.40?1.80%、豆柏1.30?1.90%、碳酸鈣0.02?0.05%、氯化鈉0.30?
0.60 %、磷酸氫二鉀0.40?0.80 %、磷酸二氫鉀0.20?0.40 %、酵母膏0.02?0.06 %、硫酸鎂0.02?0.05 %、硫酸錳0.01?0.03 %、麩皮0.30?0.80 %、泡敵0.01?0.02 %，余量為水，pH 6.5?7.5 ;
[0011](3)將步驟(2)制得的種子菌液接種于發酵培養基中，在溫度34?37°C，溶氧值20?70mg/L，發酵培養至18?22小時，按發酵液體積百分比的20%?25%添加補料液，繼續發酵，發酵至24?32小時，制得巨大芽孢桿菌發酵液；
[0012]所述發酵培養基按質量百分比，由如下組分組成:麩皮1.60?2.00%、豆柏
1.50?2.00 %、碳酸鈣0.05?0.1 %、氯化鈉0.30?0.60 %、磷酸氫二鉀0.40?0.80 %、磷酸二氫鉀0.20?0.40 %、硫酸鎂0.02?0.05 %、硫酸錳0.01?0.03 %、淀粉0.50?
1.00%、泡敵 0.01 ?0.02%，余量為水，pH 6.5 ?7.5 ;
[0013]所述補料液，組分如下
[0014]碳酸鈣2.0?5.0g/L，小麥次粉30?80g/L，余量為水。
[0015]根據本發明優選的，所述步驟(1)中，活化條件為:34?37°C活化培養2?3天。
[0016]根據本發明優選的，所述步驟(1)中，活化的活化培養基，組分如下:
[0017]牛肉膏0.20?0.50 %、氯化鈉0.30?0.80 %、蛋白胨0.80?1.20 %、瓊脂
1.80 ?2.00%，余量為水，pH 7.0 ?7.5 ;
[0018]根據本發明優選的，所述步驟(1)中，固體培養基按質量百分比，由如下組分組成:
[0019]牛肉膏0.20?0.50 %、氯化鈉0.30?0.80 %、蛋白胨0.80?1.20 %、瓊脂
1.80 ?2.00%，余量為水，pH 7.0 ?7.5 ;
[0020]根據本發明優選的，所述巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)選自:
[0021]中國普通微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏號CGMCC1.223 ;中國農業微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏號:ACCC02991 ;中國農業微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏號:ACCC03031 ;中國農業微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏號:ACCC03044 ;中國農業微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏號:ACCC03116之一。
[0022]本領域技術人員均可以預料到，由于巨大芽孢桿菌具有共同的生物學特性，因此采用其他巨大芽孢桿菌進行替換后，也能達到相同的技術效果。
[0023]—種巨大芽孢桿菌的芽胞化促進劑，組分如下，均為重量份:
[0024]碳酸鈣2?5份，小麥次粉30?80份。
[0025]根據本發明優選的，所述的芽胞化促進劑，組分如下，均為重量份:
[0026]碳酸鈣3?4份，小麥次粉40?70份。
[0027]本申請所述的培養基和補料液的滅菌條件均可采用本領域常規的滅菌條件:121°C、0.llMpa 滅菌 20 ?30min。
[0028]有益效果
[0029]本發明通過對培養條件及培養基成分的選擇，同時在發酵的過程中添加巨大芽孢桿菌的芽胞化促進劑，提高了巨大芽孢桿菌活菌數和芽孢率，制得的發酵液中活菌數可以達到8.0X109CFU/ml以上，經結晶紫染色后油鏡觀察，芽孢率95%以上，可顯著提高產品的芽孢數和產品質量。
【具體實施方式】
[0030]下面結合實施對本發明的技術方案做進一步說明，但本發明所保護范圍不限于此。
[0031]生物材料來源:
[0032]實施例1中所述巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)來源于中國農業微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏號為:ACCC 02991。
[0033]實施例2中所述巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)來源于中國農業微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏號為:ACCC 03031。
[0034]實施例3中所述巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)來源于中國農業微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏號為:ACCC 03044。
[0035]實施例4中所述巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)來源于中國農業微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏號為:ACCC 03116。
[0036]實施例5中所述巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)來源中國普通微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏號為:CGMCC 1.223。
[0037]實施例1
[0038]—種高芽孢率的巨大芽孢桿菌的發酵方法，包括以下步驟:
[0039](1)將保存于_4°C的巨大芽孢桿菌斜面劃線接種于斜面培養基上，37°C活化培養2天，制得活化后的菌體；
[0040]活化培養基按質量百分比，由如下組分組成:牛肉膏0.30%、氯化鈉0.50%、蛋白胨0.90%、瓊脂2.00%，余量為水，pH 7.2 ；
[0041]然后將活化后的菌體用無菌生理鹽水洗下后接種于茄形培養瓶中的固體培養基上，37°C靜置培養3天，制得二次活化后的巨大芽孢桿菌；
[0042]固體培養基按質量百分比，由如下組分組成:牛肉膏0.30%、氯化鈉0.50%、蛋白胨0.90%、瓊脂2.00%，余量為水，pH 7.2 ；
[0043](2)將步驟(1)制得的二次活化后的巨大芽孢桿菌接種于種子培養基中，在溫度37°C，溶氧值20?70mg/L，通氣比例:起始通氣比為1: 0.5，當溶氧值低于20mg/L時加大通氣比為1:1，當溶氧值回升高于70mg/L時降低通氣比，攪拌轉數:起始為150rpm，根據溶氧值調整(溶氧值升高，降低攪拌轉數；溶氧值降低，升高攪拌轉數)最大攪拌不超過200rpm，發酵培養16小時，制得種子菌液；
[0044]所述種子培養基按質量百分比，由如下組分組成:
[0045]蔗糖1.50%、豆柏1.40%、碳酸鈣0.03%、氯化鈉0.50%、磷酸氫二鉀0.40%、磷酸二氫鉀0.20 %、酵母膏0.03 %、