對六價鉻具有還原能力的纖維菌及用圖
【專利說明】對六價銘具有還原能力的纖維菌及用途
[0001]
技術領域： 本發(fā)明設及六價銘污染的微生物修復領域，具體設及一株對六價銘具有高效還原能力 的菌株及應用方法。 陽00引【背景技術】： 由于人類對金屬礦的開采、冶煉、加工及工業(yè)生產等活動日益增多，使得大量重金屬如 銘、鉛、儒、隸等進入±壤中，造成嚴重的環(huán)境污染，引起了研究人員的廣泛關注。重金屬在 ±壤中不易隨水淋溶，不能被微生物降解，并能通過食物鏈在生物體內富集，甚至轉化為毒 性更強的化合物。
[0003] 銘及其化合物是重要的工業(yè)原料，廣泛應用于電鍛、制革、印染等行業(yè)，大量含銘 廢水、廢氣和廢渣的排放對環(huán)境造成了嚴重污染。銘作為常見的重金屬污染物之一，在環(huán)境 中W多種價態(tài)存在，其中主要ΚΞ價銘和六價銘為主，兩者在環(huán)境中表現出截然不同的行 為特征。六價銘毒性強，溶于水，易被植物吸收，在環(huán)境中主要W化〇42^、化〇72^存化不易 被±壤顆粒吸附，遷移性強，容易造成地下水污染，對生物體產生致突變和致癌的作用。Ξ 價銘毒性小，在環(huán)境中主要W難溶的氨氧化銘存在，活性較差，對植物的毒害作用較輕，有 研究表明六價銘的毒性是Ξ價銘的100倍左右。環(huán)境中的Ξ價銘和六價銘可W通過氧化還 原反應相互轉化。目前針對銘污染±壤的傳統(tǒng)修復治理方法有固定化/穩(wěn)定化、化學還原、 化學淋洗、電動修復和植物修復等，但大多對場地要求較高，限制較多；對于含銘工業(yè)廢水 的處理，則有硫酸亞鐵法、離子交換法和微生物還原法。而微生物處理技術與傳統(tǒng)處理技術 相比，具有快速、安全、費用低等優(yōu)點，被稱為新興的環(huán)境友好替代技術。
[0004] 因此，從銘污染±壤中分離微生物，并充分利用±壤本身的特點，有針對性地將其 應用于污染±壤及水體修復，是一種較為理想的修復方法，避免了對在污染修復的同時產 生二次污染，經濟效益和生態(tài)效益顯著，對于生態(tài)環(huán)境保護和可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。 陽0化]自20世紀70年代起，研究人員發(fā)現一些微生物能夠還原含銘廢水中的六價銘，之 后人們在微生物還原六價銘的領域里做了大量相關研究，并分離出多種具有六價銘還原能 力的微生物。能夠對六價銘進行還原的微生物可W從銘污染嚴重的地點進行采集分離，如 銘渣堆放場、制革污水排放點、礦場W及電鍛廢水等，并表現出不同的六價銘耐受和還原能 力，主要有無色桿菌、大腸桿菌、硫桿菌、芽胞桿菌、脫硫弧菌、微球菌W及假單胞菌等。
[0006]
【發(fā)明內容】
： 本發(fā)明的目的在于提供一種高效抗六價銘毒性的對六價銘具有還原能力的纖維菌。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述纖維菌在修復六價銘污染±壤和含六價銘的廢 水處理中的應用。
[0008] 發(fā)明是運樣實現的： 對六價銘具有還原能力的纖維菌，其拉下文名Cellulosimicrobiumsp.，保藏單位：中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。 保藏日期：2015年10月16日，保藏編號：CGMCCNO. 11511。
[0009] 所述的纖維菌在修復六價銘污染農田±壤的應用。
[0010] 所述的纖維菌在修復六價銘污染±壤的應用，所述農作物為水稻、小麥、玉米、油 菜、蔬菜、水果，在農作物種植過程中施用W纖維菌為主要成分的微生物菌劑，可有效減少 ±壤中六價銘的含量，減少銘進入植株體內，進而阻止銘通過植株可食器官污染食物。
[0011] 所述的纖維菌在六價銘污染廢水處理中的應用。
[0012] 所述的纖維菌在六價銘污染廢水處理中的應用，該菌株還原六價銘過程中抑值 為5-9 ;初始六價銘濃度不超過300mg/kg;銘污染廢水中添加薦糖、葡萄糖、果糖或淀粉 中的一種或其中任意幾種的組合，添加量為按廢水質量的0.1-1% ;銘污染廢水中添加硫 酸錠、硝酸鐘、氯化錠或酵母膏中的一種或其中任意幾種的組合，添加量為按廢水質量的 0. 1-1% ;銘污染廢水中添加碳酸巧，添加量為按廢水質量的0. 1-0. 5%。 陽01；3] 本發(fā)明纖維菌Cellulosimicrobiumsp.，自編號LY22,詳細分離篩選步驟如下： (1)樣品采集：2012年10月采取銘渣污染±壤0-20cm±層樣品。
[0014] (2)富集培養(yǎng)：稱取10肖±樣于滅菌的液體培養(yǎng)基(液體培養(yǎng)基成分為：薦糖10 邑·L-i，K2HPO42邑·L-i，（畑4)S〇41 邑·L-i，MgS〇4· 7&0 0. 5 邑·L-i，CaC〇30. 5 邑·L-i， 酵母膏0.5g-L-i，化Cl0. 1g-L-i，銘酸鐘0.4g-L-i，抑7.0)中，28°C培養(yǎng)箱振蕩培 養(yǎng)4化后吸取10ml培養(yǎng)液進行傳代培養(yǎng)，傳代5次。
[0015] (3)六價銘抗性菌株分離：吸取10ml富集培養(yǎng)液至裝有90ml無菌生理鹽水的Ξ 角瓶中，于28°C搖床振蕩30min，再一次吸取1ml到9ml無菌生理鹽水中逐步稀釋至不同 梯度，分別取不同稀釋梯度菌懸液0.1ml涂布在含200mg六價銘的有氮改良固體培養(yǎng) 基（薦糖 10g·L-1，K2HPO42g·L-1，（畑4化〇41g·L-1，Μ拆〇4· 7&0 0. 5g·L-1，CaC〇3 0. 5g·L-i，酵母膏 0. 5g·L-i，化Cl0. 1g·L-i，銘酸鐘 0.8g·L-i，瓊脂 18g·L-i， pH7. 0)平板上，于28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天，長出的菌株為六價銘抗性菌株。
[0016] (4)六價銘抗性菌株劃線分離：將步驟（3)中得到的六價銘抗性菌株挑取不同的 菌落進行平板劃線培養(yǎng)，并進行復篩驗證直到分離到純菌落，將菌株接種到斜面培養(yǎng)基(薦 糖 10 邑·L_1，K2HPO42 邑·L_1，（畑4)8〇41 邑·L_1，Μ拆〇4· 7&0 0. 5 邑·L_1，CaC〇30. 5g.L-i，酵母膏0. 5g.L-i，化Cl0. 1g.L-i，瓊脂18g.L-i，抑 7.0)上，菌長出后放4°C 冰箱中備用，并用甘油冷凍管保存一份于一80°C。
[0017] (5)纖維菌篩選：六價銘抗性菌株培養(yǎng)至對數期，按1%接種量接種至六價銘濃 度為 100mg·L-1 的液體培養(yǎng)基(薦糖 10g·L-1，K2HPO42g·L-1，（畑4化〇41g·L-1， Μ拆O4· 7&0 0. 5g·L-i，CaC〇30. 5g·L-i，酵母膏 0. 5g·L-i，化Cl0. 1g·L-i，銘酸 鐘0.4g-L^i，抑7.0)，置28°C培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)4化后離屯、，用二苯碳酷二阱比色法測定 上清液中Cr6+含量，W不接種菌株的培養(yǎng)液為對照。測定結果表明：與對照相比，接種菌株 后，92%的六價銘被還原成Ξ價銘，六價銘還原率高。
[0018] (6)菌株固氮能力測定：將菌株點接到Ashby無氮培養(yǎng)基平板(甘露醇10g吃一1、 KH2PO40. 2 邑·L-1、MgS〇4· 7&0 0. 2 邑·L-1、NaCl0. 2 邑·L-1、CaS〇4· 2&0 0. 2 邑·L-1、 CaC〇35g·L^、瓊脂18g·L^、抑7. 2)上，28°C倒置培養(yǎng)5d，菌株能正常生長，轉接5次 W后仍能正常生長。
[0019] 對六價銘具有高效還原能力的纖維菌，具有如下特征： 1)菌落形態(tài)特征：在高氏一號培養(yǎng)基上菌落不規(guī)則、不透明、白色。
[0020] 2)菌體形態(tài)特征：利用電鏡形態(tài)鑒定和革蘭氏染色分析。特征如下：革蘭氏陽性， 長桿狀。
[0021] 3)生理生化特征：甲基紅（ + )、V.P反應（ + )、過氧化氨酶（ + )、氧化酶（ + )、明膠水 解（+)、嗎I噪（一)、巧樣酸鹽（+)、淀粉（+)。
[0022] 4)對六價銘還原能力： 本發(fā)明在實驗室條件下驗證結果表明該纖維菌對六價銘有高效還原作用，可用于重金 屬銘污染±壤及水體的生物修復。 W23] 5)分子生物學鑒定：利用16SrDNA鑒定，采用通用引物27F和1492R擴增 其16SrDNA并測序，再與NCBIGenBank核酸數據庫比對，同源性為99%，鑒定為纖維菌Cellulosimicrobiumsp.。
[0024] 6)將上述分離得到的菌株命名為LY22,經形態(tài)學特征觀察和分子生物學鑒定，確 認該菌為纖維菌（Cellulosimicrobiumsp.)。該菌株于2015年10月16日送交中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、（CGMCC)登記保藏，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1 號院3號。其保藏號為CGMCCNO. 11511。分類命名為：纖維菌（Cellulosimicrobiumsp.)。
[0025] 本發(fā)明通過大棚條件下用六價銘污染的±壤接種該菌株進行盆栽放大種植試驗， 結果表明該菌對六價銘具有高效還原作用，能減少±壤中六價銘的含量，高效阻止銘進入 植物體內，減緩六價銘對植株脅迫作用，促進作物生長。在實驗室條件下，六價銘污染廢水 接種該菌株進行處理，結果表明該菌能有效還原水體中六價銘，水體由"黃"變清，六價銘還 原率達92%W上。該菌株對六價銘污染的±壤、水體生物修復方面有著良好的應用前景。 [00%] W下節(jié)【具體實施方式】來進一步說明本發(fā)明提供的纖維菌的用途。
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【具體實施方式】： 實施例1: 纖維菌（Cellulosimicrobiumsp. )LY22的制備方法，具體操作如下： (1)樣品采集：2012年10月采取銘渣污染±壤0-20cm±層樣品。
[0028] (2)富集培養(yǎng)：稱取lOg±樣于滅菌的液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)4化后 吸取10ml培養(yǎng)液進行傳代培養(yǎng)，傳代5次。液體培養(yǎng)基成分為：薦糖10g·L^，K2HPO42 邑·L-i，（畑4)SO41 邑·L-i，MgS〇4· 7&0 0. 5 邑·L-i，CaC〇30. 5 邑·L-i，酵母膏 0. 5 邑·L- 1，化Cl0. 1g·L-1，銘酸鐘 0. 4g·L-1，pH7. 0。
[0029] (3)六價銘抗性菌株分離：吸取10ml富集培養(yǎng)液至裝有90ml無菌生理鹽水的Ξ 角瓶中，于28°C搖床振蕩30min，再一次吸取1ml到9ml無菌生理鹽水中逐步稀釋至不同 梯度，分別取不同稀釋梯度菌懸液0. 1ml涂布在含200mg·L^i六價銘的(薦糖10g·L一1， 馬冊〇4 2g·L-1，（畑4化〇4 1g·L-1，Μ拆〇4 · 7&0 0. 5g·L-1，CaC〇3 0. 5g·L-1，酵母膏 0. 5 邑·L-1，NaCl0. 1 邑·L-1，銘酸鐘 0. 8 邑·L