一種格氏沙雷氏菌（Serratia grimesii）C13及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種菌株，特別是一種格氏沙雷氏菌（5krraiia巧C13,本發(fā) 明還公開了該菌株的用途。
【背景技術(shù)】
[000引泥餓（必/端·?//77化？a化化/別化)因?yàn)樗r嫩的肉質(zhì)，豐富的營養(yǎng)，且具有高 蛋白低脂肪等特點(diǎn)，有食用、藥用的雙重價(jià)值，現(xiàn)已成為我國主要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類之一。然 而隨著泥餓養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大而引發(fā)的泥餓病害問題也日趨嚴(yán)重，給泥餓養(yǎng)殖業(yè)造成了很大 的經(jīng)濟(jì)損失。凡隆氣單胞菌UeiOWonasKertwii)是引發(fā)泥餓細(xì)菌病害的病原菌之一，它 侵染泥餓后，泥餓表現(xiàn)為身體發(fā)紅，體表有出血點(diǎn)，嚴(yán)重的情況下皮膚會(huì)產(chǎn)生潰瘍?cè)睿劳?率能夠高達(dá)60%。泥餓病害的防治多采用抗生素，進(jìn)而引發(fā)病原菌的耐藥性及抗生素的殘留 等環(huán)境的二次污染。
[0003] 益生菌是通過改善內(nèi)源性微生物，對(duì)動(dòng)物或人類施加有益影響的單一或混合的 活微生物，益生菌W其不會(huì)對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物造成危害、環(huán)境友好而備受重視，近年來廣泛應(yīng)用于 水產(chǎn)病害防治。因此，研發(fā)新的益生菌應(yīng)用于水產(chǎn)病害防治具有重要的意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的較強(qiáng)抑制凡隆 氣單胞菌生長的益生菌格氏沙雷氏菌（5krra巧C13。
[0005] 本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供了前述格氏沙雷氏菌Werraiia 鮮i曲esii ) C13的用途。
[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過W下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明公開了一種 格氏沙雷氏菌鮮i曲esii)C13,其特點(diǎn)是：其保藏號(hào)為CCTCCNo:M2015473。
[0007] 本發(fā)明菌株格氏沙雷氏菌巧'ia?e5ii)C13 (?下簡(jiǎn)稱格氏沙雷氏菌C13 或者C13)菌株已于2015年7月23日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、CCTCC，保藏編號(hào) 為CCTCCNo:M2015473 ;保藏單位地址：中國武漢市武漢大學(xué)，電話：027-68754052,郵編： 430072ο
[0008] 本發(fā)明所述的格氏沙雷氏菌巧C13,進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案 是，其保藏方法為：挑取格氏沙雷氏菌C13菌落接入5mL牛肉膏蛋白腺液體培養(yǎng)基中， 28°C，160巧m搖床培養(yǎng)過夜；取1.5血離屯、管，按1:1的比例將發(fā)酵液與滅過菌的30 % 甘油混合裝入其中，顛倒數(shù)次混勻后放入-70 °C冰箱保存。
[0009] 本發(fā)明所述的格氏沙雷氏菌巧C13,進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案 是，其分離篩選方法如下： (1)分離純化：從泥餓養(yǎng)殖池采集水樣，將采集的水樣按濃度梯度進(jìn)行稀釋涂布于牛肉 膏蛋白腺固體培養(yǎng)基上，選擇菌落分散度適宜的平板，根據(jù)菌落顏色、大小、形狀、邊緣整齊 度、質(zhì)地特征，挑選出不同特征的菌落，將其多次Ξ區(qū)劃線直到得到純培養(yǎng)物C1-C16共16 個(gè)純培養(yǎng)物； (2) 發(fā)酵：挑取上述純培養(yǎng)物單個(gè)菌落分別接入5mL牛肉膏蛋白腺液體培養(yǎng)基中， 28°C，160rpm搖床培養(yǎng)過夜，得發(fā)酵液用于篩選； (3) 篩選：病原菌凡隆氣單胞菌UerowonasKertwii)同步進(jìn)行活化，制得菌液；采 用雙層瓊脂平板法進(jìn)行抑菌篩選：先在培養(yǎng)皿中的底層倒入牛肉膏蛋白腺固體培養(yǎng)基，待 其凝固后，再倒入含有凡隆氣單胞菌UerowonasKenwii)菌液的牛肉膏蛋白腺半固體培 養(yǎng)基；在上層半固體培養(yǎng)基上打孔，注入適量步驟（2)所得發(fā)酵液，放在28°C的培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，第Ξ天觀測(cè)抑菌圈大小；篩選得到C13菌株。
[0010] 本發(fā)明所述的格氏沙雷氏菌巧'i曲esii)C13可W用來制備抗凡隆氣單 胞菌UerowonasKeronii)水產(chǎn)藥物。
[0011]W下對(duì)本發(fā)明格氏沙雷氏菌C13進(jìn)行進(jìn)一步地闡述。
[0012] 菌株C13的分離篩選及保存 1. 1凡隆氣單胞菌括抗菌的分離純化 從連云港崗璋農(nóng)場(chǎng)9號(hào)泥餓養(yǎng)殖池于2013年7月14日、7月29日、8月14日、8月29 日、9月14日和9月29日等6個(gè)日期采集水樣，將采集的水樣按濃度梯度進(jìn)行稀釋涂布于 牛肉膏蛋白腺固體培養(yǎng)基上，選擇菌落分散度適宜的平板，根據(jù)菌落顏色、大小、形狀、邊緣 整齊度、質(zhì)地等特征，挑選出不同特征的菌落，將其多次Ξ區(qū)劃線直到得到純培養(yǎng)物，共16 個(gè)，編號(hào)依次為C1，C2,C3……C16。
[0013] 1.2純培養(yǎng)物的保藏 挑取上述純培養(yǎng)物單個(gè)菌落接入5血牛肉膏蛋白腺液體培養(yǎng)基中，28°C，160rpm搖床 培養(yǎng)過夜。取1.5mL離屯、管3-5支，按1:1的比例將發(fā)酵液與滅過菌的30 %甘油混合裝 入其中，顛倒數(shù)次混勻后放入-70 °C冰箱保存。其余發(fā)酵液用于括抗菌的篩選。
[0014] 凡隆氣單胞菌括抗菌的篩選 病原菌凡隆氣單胞菌同步進(jìn)行活化，制得菌液。采用雙層瓊脂平板法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)：先 在培養(yǎng)皿中的底層倒入牛肉膏蛋白腺固體培養(yǎng)基，待其凝固后，再倒入含有凡隆氣單胞菌 菌液的牛肉膏蛋白腺半固體培養(yǎng)基。在上層半固體培養(yǎng)基上打孔，注入一定量篩選出的括 抗菌的菌液，放在28°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第Ξ天觀測(cè)抑菌圈大小。
[0015] 通過Ξ次實(shí)驗(yàn)從中篩選出5株具有括抗效果的菌株，見表1。經(jīng)第四次實(shí)驗(yàn)，從運(yùn) 5個(gè)菌株中挑選出抑菌效果明顯，而且表現(xiàn)較穩(wěn)定的C13菌株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0016] 表1括抗菌株的抑菌實(shí)驗(yàn)
注:+表示對(duì)凡隆氣單胞菌具有括抗作用，++表示具有較強(qiáng)的括抗作用，-則表示無括 抗作用。W表示已淘汰 3括抗菌C13的菌株鑒定 1. 1 C13的形態(tài)特征觀察 通過Ξ區(qū)劃線得到單菌落，肉眼觀察結(jié)合低倍放大鏡，從顏色、大小、形狀、邊緣整齊 度、質(zhì)地等方面描述單菌落形態(tài)特征。結(jié)果表明。C13菌落呈淡黃色，楠圓形，邊緣不整齊， 表面光滑、濕潤、不透明，與培養(yǎng)基緊密結(jié)合，如圖1。在顯微鏡（4X10)下觀察C13單個(gè)菌 落，結(jié)果見圖2。革蘭氏染色如圖3。
[0017] 的leSrRNA基因鑒定 (1)C13菌株基因組DNA提取及16SrDNA擴(kuò)增 按細(xì)菌基因組DNA常規(guī)提取方法提取C13總DNA，并用細(xì)菌16SrRNA基因通用引物 27F/1492R擴(kuò)增C13 16SrDNA片段，結(jié)果如圖4。
[001引 由圖4看出，擴(kuò)增到的16SrDNA片段約1500bp，條帶清晰。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海 生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果為1450bp。
[0019] (2)C13菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位分析 使用NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中屯、）網(wǎng)站中的BLAS軟件，將C13的16SrDNA序列與已知菌株的16SrDNA序列比較其同源性。通過比較顯示，C13的16SrDNA序列與 巧'i曲esii(T)DSM30063的同源性最高，達(dá)到96 %。用MEGA5. 10繪制C13的 系統(tǒng)發(fā)育樹，與況?rraiia鮮i曲esii燈）DSM30063的遺傳距離也達(dá)到90 (見圖5)，因此 敬堿名丸Serratia grimesii
[0020] 的生長曲線及同步抑菌活性鑒定 取5mL括抗菌發(fā)酵液接種于100mL牛肉膏蛋白腺液體培養(yǎng)基中，28°C，160rpm培養(yǎng)， 每2h取樣品4mU其中3mL用分光光度計(jì)測(cè)定ODe。。，不接菌的培養(yǎng)基作對(duì)照，繪制生長 曲線；另1mL用于檢測(cè)抑菌活性，每個(gè)菌株的實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可W看出，C13延 滯期為0h~2h，對(duì)數(shù)期為2h~10h，10h后進(jìn)入穩(wěn)定期。10h后開始產(chǎn)生抑菌圈，24h 時(shí)抑菌圈最大，達(dá)到1.12cm。因此發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)W培養(yǎng)24h收獲菌液為宜。
[0021] 的發(fā)酵條件優(yōu)化 5. 1培養(yǎng)基起始抑對(duì)括抗菌抑菌活性的影響 將100mL的牛肉膏蛋白腺液體培養(yǎng)基裝于2