一株柴油降解菌及其菌劑和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物技術領域，具體涉及一株柴油降解菌以及該菌株在環境治理領域的應用，尤其是在涉及石油烴類污染的生物治理領域的應用。
【背景技術】
[0002]柴油屬于輕質石油產品，廣泛用于大型車輛、船艦、發電機等。隨著世界對石油烴類物質需求的增長，在海上開采、運輸、裝卸以及利用石油過程中的溢油事故也日漸增多，造成嚴重的環境污染。石油烴類污染物具有潛在毒性，會導致一些珍貴海洋動物的死亡，破壞生態系統的功能，對近海生態敏感去(養殖區、旅游區等)也帶來巨大的經濟損失。另外石油烴類污染物中的致癌、致畸等物質經過生物累積過程，通過食物鏈會對人類的健康產生嚴重的威脅。因此，研究近海柴油污染物的控制與修復問題對于保護海洋生態系統，保障人類健康安全，促進經濟和社會的可持續發展具有重要意義。
[0003]微生物修復技術是指通過微生物的作用清除土壤和水體中的污染物，或是使污染物無害化的過程。相比于傳統的物理、化學等油污治理方法，微生物降解修復法具有成本低、處理效率高、易于管理、無二次污染等優點，是去除環境中石油污染物的主要途徑。其降解的主要過程包括石油烴吸附在微生物細胞膜表面、石油烴進入細胞膜內、石油烴與細胞內降解酶結合發生酶促反應。因此，石油烴污染修復的關鍵因素之一是尋求高效降解石油烴的微生物，尤其依賴于已經適應海洋環境的各種土著石油降解微生物。
【發明內容】
[0004]本發明公開了一株柴油降解菌，本發明還公開了利用該柴油降解菌制備的菌劑，以及利用該菌和菌劑在降解柴油中的應用。
[0005]為了達到上述目的，本發明采用如下技術方案:
[0006]—株柴油降解菌，其特征在于:該菌為劍菌(Ensifer sp.)C2-10，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M2014653o
[0007]利用上述柴油降解菌在降解柴油中的應用。
[0008]所述柴油為烷烴類化合物。
[0009]—種含有上述柴油降解菌的微生物菌劑。
[0010]上述微生物菌劑的制備方法，將所述柴油降解菌與載體混合培養，離心后取出載體，用生理鹽水清洗，再次離心得到固定化微生物菌劑。
[0011]所述培養方式為在30?35°C溫度下，180?220r/min振蕩培養36?42h，載體吸附的有效活菌數為2X 10s?4X10 sCFU/g。
[0012]所述載體為稻桿與無紡布的混合物，長度為1?4cm。
[0013]所述秸桿和無紡布的質量比為1-1.5:1.5ο
[0014]利用上述微生物菌劑在降解柴油中的應用。
[0015]所述柴油為烷烴類化合物
[0016]本發明的有益效果在于:
[0017](1)本發明的柴油降解菌不產生表面活性劑，但具有較好的細胞親油性，可通過直接與油滴接觸并對其進行攝取，達到降解海洋中的柴油的效果。
[0018](2)本發明的柴油降解菌環境適應能力較強，在海洋及土壤環境中均可以良好生長，可以解決海洋以及土壤的石油烴類污染，具有極大的應用價值。
[0019](3)本發明的柴油降解菌可在以柴油為唯一碳源的MMC培養基中生長，具有較好的親油性和表面張力。在最適條件(溫度為30°C、pH為7.6、轉速為22(^/11^11、柴油濃度為20g/L)下柴油降解率可達到70.0%，并對柴油組分C17、C18和C21-C27等中、長鏈烷烴的降解率高達100%。
[0020](4)采用本發明的柴油降解菌制備的菌劑對柴油具有良好的去除效果，在模擬海洋系統試驗中，10d內對柴油的去除率為48.4%。
[0021]保藏信息
[0022]本發明提供的柴油降解菌，為劍菌(Ensifer sp.) C2-10，保藏于中國典型培養物保藏中心，地址:中國.武漢.武漢大學，保藏編號為CCTCC NO:M2014653，保藏日期為2014年12月19日。
[0023]說明書附圖
[0024]圖1為實施例3中生物降解后柴油中烷烴含量。
【具體實施方式】
[0025]以下結合實施例對本發明作進一步的描述。下述實施例中的試驗方法如無特殊說明，均為常規方法，所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑市場購買得到，以下的“ ％ ”如無特殊說明，均為質量百分含量。
[0026]實施例1:本發明柴油降解菌富集分離及鑒定
[0027]采集深圳港口表層海水樣品，取5mL海水樣品加入100mL以柴油為唯一碳源的MMC培養基中，置于30°C、180r/min的搖床中培養7d。MMC的配方為(每升含量):NaCl 24g，MgS04.7Η20 7g，NH4N03lg，KCl 0.7g,KH2P042g,Na2HP043gopH 7.4，1.0X 105Pa滅菌30min后，補加微量元素混合液(每升含量):CaCl20.02g，FeCl3.6Η20 0.5g，CuS040.00 5g，MnCl2.4Η20
0.005g，ZnS04.7H20 0.lg。
[0028]隨后取5mL培養液轉接至新鮮的柴油培養基，重復以上步驟，連續轉接富集培養4次，培養基中柴油量依次提升至1.0g、1.5g、2.0g。將柴油乳化現象明顯的富集液梯度稀釋，取0.lmL涂布于2216E平板，30°C培養3-5d，待長出菌落后，挑取不同形態和顏色的單菌落，多次劃線純化分離單菌。
[0029]經反復富集分離純化得到一株柴油降解菌。平板觀察該菌落呈乳白色，圓形，邊緣整齊，表面光滑、突起，有粘液，菌落直徑2-4mm菌落。鏡檢菌體呈桿狀，(0.5-0.9) X (1.2-3.0) μ m，革蘭氏染色陰性。
[0030]參考《常見細菌系統鑒定手冊》對柴油降解菌生理生化特征進行分析，結果為:接觸酶陽性，氧化酶陽性，不產H2s，Μ.R實驗陰性，V-P實驗陰性，硝酸鹽還原陰性，檸檬酸鹽陰性，苯丙氨酸脫氨酶陽性，淀粉水解實驗陰性，葡萄糖產酸不產氣，明膠液化實驗陰性，15-40°C范圍生長，7% NaCl生長實驗陰性。
[0031]將各菌株用無菌牙簽依次挑至兔血平板培養基上，30°C培養2-3d，根據菌落周圍透明圈的大小判斷所產表面活性劑的濃度，并測定細胞親油性。將活化后的柴油降解菌接種于2216E培養基中制備種子液，離心、用無菌MMC洗滌2次，以5%的比例接種到柴油培養基中，以不接菌的培養基作為空白對照，30°C、180r/min培養5d。采用鉑金環式表面張力測定儀測定培養液的表面張力。結果為:該柴油降解菌不產生表面活性劑，表面張力為39.39 ±5.llmN/m,比對照有明顯下降，親油性較好。
[0032]16S rDNA序列，見核苷酸序列表所示。將所測