一株拮抗四種鐮孢屬真菌的內生青霉菌及其應用
【專利說明】-株括抗四種編抱屬真菌的內生青霉菌及其應用 (-)技術領域
[0001] 本發明設及一株括抗四種鑲抱屬真菌的內生青霉菌及其應用，屬于果樹栽培領 域。 (二）【背景技術】
[0002] 蘋果連作障礙由來已久，病因復雜。在多數地區，與±傳真菌有關的生物因素是造 成連作障礙的主要原因。已報道與蘋果連作障礙有關的主要致病真菌屬有鑲抱屬、柱抱屬、 立枯絲核屬、疫霉屬和腐霉屬等。不同地區、不同果園連作±壤中的致病真菌不同，有研究 認為鑲抱菌屬真菌是引起蘋果連作障礙的主要病原之一。VanSchoor研究發現在南非所有 連作蘋果園中±壤有害真菌鑲抱屬、柱抱屬W及腐霉屬是引起連作障礙的主要原因。
[0003] 輪作、±壤化學消毒（如漠甲燒）等措施曾被用來防控蘋果連作障礙。輪作是目 前防控蘋果連作障礙效果最好的措施之一，缺點是耗時太長，一般輪作時間不能低于Ξ年， 生產中不易推廣。漠甲燒等化學熏蒸劑污染環境且對人體有害，已被禁止使用，而生物防控 是利用有益菌抑制±壤中真菌的數量或干擾真菌對寄±植物侵染的一種環保型防治方法， 對蘋果連作障礙進行生物防治是一種前景廣闊的技術措施。Shin等研究認為青霉菌可產生 大量生物活性成分并對真菌，植物線蟲等的生長發育可能有不同程度的抑制作用，且青霉 菌化nicilliumsimplicissimumIFM53375.中分得的化nicillide(l-4)類化合物及其衍 生物具有抗真菌活性作用，同時青霉菌分泌的青霉素對根皮巧有降解作用，而在蘋果連作 障礙中生防青霉菌的相關研究未見報道。 (Ξ)
【發明內容】
[0004] 為了解決上述問題，本發明設及一株括抗四種鑲抱屬真菌的內生青霉菌及其應 用；本發明從連作平邑甜茶健康根系內部分離到一株具有生防功能的內生青霉菌，通過與 串珠、腐皮、尖抱和層出病原鑲抱菌的對時試驗探討其生防機理，用于蘋果連作障礙的防 控，具有重要的理論和實踐意義。
[0005] 本發明首先分離得到一株內生青霉菌。
[0006] 一株括抗四種鑲抱屬真菌的內生青霉菌，來源于連作平邑甜茶的健康根系，經人 工分離、篩選得到。該菌株鑒定為草酸青霉（Penicilliumoxalicum)，命名為內生草酸青 霉A1，菌落平坦，菌絲初為白色后逐漸變為暗綠色，分生抱子梗頂端形成掃靑狀的分枝，分 生抱子楠圓形，光滑。
[0007] 一株內生草酸青霉A1(Penicilliumoxalicum)，已于2015年7月14日保藏于中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，保藏名：A1 ;保藏號：CGMCCNo. 11111 ;保 藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號的中國科學院微生物研究所；郵編：100101。
[0008] 本發明還對內生草酸青霉A1的功能進行了驗證：一方面提供了內生草酸青霉A1 在PDA和玉米粉培養基上與腐皮、層出、串珠和尖抱鑲抱菌的對時試驗結果，說明內生草酸 青霉A1對引起蘋果連作障礙的主要鑲抱屬真菌（腐皮、層出、串珠和尖抱）有明顯的括抗 作用；另一方面提供了內生草酸青霉A1對根皮巧的降解效果，說明內生草酸青霉A1可減輕 由根皮巧引起的蘋果連作障礙。
[0009] 本發明分離得到的內生草酸青霉A1，生長速度快，抱子大量繁殖，能夠在很短的時 間內占據大部分的生存空間，對引起蘋果連作障礙（腐皮、層出、串珠和尖抱）鑲抱菌真菌 有很強的括抗作用，并對根皮巧有一定的降解作用，為蘋果連作障礙的生物防控提供了理 論依據和技術基礎。 (四）
【附圖說明】
[0010] 圖1為內生草酸青霉A1在PDA和CA培養基上的形態特征觀察；
[0011] 圖2為內生草酸青霉A1的典型掃靑狀分生抱子形態W及分生抱子梗形態圖；
[0012] 圖3為內生草酸青霉A1的口SrDNA片段1 %瓊脂糖凝膠電泳結果圖
[0013] 從圖中可W看出，內生草酸青霉A1的口SrDNA片段長度約為55化P，符合常規的 口SrDNA序列長度；
[0014] 圖4為利用口SrDNA同源性序列和鄰接法構建的該菌株的系統發育樹
[0015] 從圖中可W看出內生草酸青霉A1與青霉屬的遺傳進化距離最近；
[0016] 圖5為內生草酸青霉A1的β-tubulin片段1%瓊脂糖凝膠電泳結果圖
[0017] 從圖中可W看出，內生草酸青霉A1的β-tubulin片段長度約為5(K)bp，符合常規 的β-tubulin序列長度； 陽01引圖6為利用β-tubulin同源性序列和鄰接法構建的該菌株的系統發育樹
[0019] 從圖中可W看出內生草酸青霉A1與青霉屬的遺傳進化距離最近；
[0020] 圖7為內生草酸青霉A1在PDA培養基上與腐皮、層出、串珠、尖抱鑲抱菌的對時試 驗
[0021] 說明：內生草酸青霉A1對尖抱、串珠、層出和腐皮鑲抱菌的菌絲生長均有不同程 度的抑制作用，在PDA培養基上菌絲生長抑制率分別為42. 0%、74. 0%、47. 0%、54. 5%，括 抗系數達到II級或I級
[0022] 圖8為內生草酸青霉A1在玉米粉培養基上與腐皮、層出、串珠、尖抱鑲抱菌的對時 試驗；
[0023] 說明：內生草酸青霉A1對尖抱、串珠、層出和腐皮鑲抱菌的菌絲生長均有不同 程度的抑制作用，在玉米粉粉培養基上菌絲生長抑制率分別為60. 5 %、82. 2 %、68. 4 %、 53. 4%，括抗系數達到II級或I級。
[0024] 圖9為根皮巧含量的標準曲線
[00巧]說明：根據六種不同根皮巧濃度的系列外標溶液建立的根皮巧濃度和吸光度回歸 方程（見圖9)，得出培養液中根皮巧的濃度。 (五）
【具體實施方式】
[00%] 本發明所設及的培養基及組分如下：
[0027] 1.PDA培養基：去皮馬鈴馨200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸饋水1000血，121°C高壓 滅菌20min，待冷卻至45°C左右時，分別加入2. 5mL鏈霉素和1. 25ml青霉素，將培養基倒入 培養皿凝固。 W28] 2.口0培養基：去皮馬鈴馨200邑，葡萄糖20邑，蒸饋水1000血，121°(：高壓滅菌 20min，待冷卻至45°C左右時，分別加入2. 5血鏈霉素和1. 25ml青霉素。
[0029] 3.CA培養基：硝酸鋼2g，憐酸氨二鐘Ig，硫酸儀0.5g，氯化鐘0.5g，硫酸亞鐵 0.Olg，薦糖30g，瓊脂20g，蒸饋水1000血，121°C高壓滅菌20min。 W30] 4.無機鹽培養基（MBM) :NH4N〇3l.Og，Μ拆〇4· 7&0 0. 5g，（NH4)2S040 . 5g， KH2PO4O. 5g，K2HPO4I. 5g，化Cl0. 5g，蒸饋水 1000血，pH7. 0。
[0031] 5.玉米粉培養基：玉米粉lOg，水20ml，12rC高壓滅菌20min，備用。 陽0巧 實施例1
[0033] 內生青霉菌的分離純化
[0034] 將連作平邑甜茶的根系做同樣的表面消毒后分成兩份，一份不進行研磨作為對照 培養。如果沒有任何菌落長出，證明植物根系表面消毒徹底，從而證明分離得到的真菌是植 物的內生真菌而不是空氣中的或組織塊表面附生菌。
[0035] 在無菌條件下，將另一份連作平邑甜茶的根系剪成1cm長的小段，置于濃度為 75 %的酒精中浸泡Imin后，無菌水沖洗2-3次；然后再放入濃度為0. 1 %的升隸中Imin(或 放入濃度為2%的化αο溶液中0. 5min)，無菌水沖洗4-5次，用濾紙吸取多余的水分。向吸 取多余水分后的根系加入無菌水研磨，研磨后的根系研磨液分別稀釋成10 1、10 2、10 3、10 4 四個梯度；涂布后平板培養，每個梯度重復3~5次（即每個梯度的根系研磨液涂布3-5個 平板）；根據各個平板上菌落的形狀、大小、干濕、顏色、質地、表面、邊緣及透明度8個表型 特征挑取青霉菌的單菌落，轉接到新的PDA平板中純化。若分離出多個不同的青霉菌菌落， 需要再次挑取青霉菌的單菌落轉接到新的PDA平板中純化，如此反復直到得到純的青霉菌 落。
[0036] 通過根系研磨液的平板稀釋涂布法，從其中發現了一株具有高抑菌活性的真菌， 在它的周圍其它菌很難生長，從而形成其特定的"勢力范圍"。對該菌進行平板劃線分離純 化，得到一株內生青霉菌（見圖1)。
[0037] 實施例2
[0038] 內生青霉菌的鑒定
[0039] 1.菌落特征和菌體形態特征 W40] (1)菌落特征
[0041] 在PDA平板上，菌落平坦或近于平坦，質地絨狀，菌絲初為白色后逐漸變為暗綠 色，分生抱子易脫落，分生抱子結構大量產生，分生抱子面深橄攬綠色；滲出液缺乏；反面 近于無色；可溶性色素缺乏。在CA平板上，菌落平坦，菌落周圍有一圈白色菌絲，質地絨狀， 菌絲體白色，分生抱子易脫落，分生抱子結構大量產生，分生抱子面深綠色；滲出液缺乏； 反面近于無色；可溶性色素缺乏（見圖1)。
[0042] (2)菌體形態特征
[0043] 顯微鏡下觀察菌株的菌絲體，營養菌絲有隔膜，分生抱子梗發生于基質，壁平滑， 靑狀枝通常雙輪生，偶有Ξ輪生或單輪生；梗基每輪2-3個，13-20X3. 2-3. 7um，彼此通常 較緊貼；瓶梗每輪5-8個或更多，10-15X2. 5-3. 2um，幼齡時呈現瓶狀或披針狀，充分成熟 時近圓柱狀，梗頸通常明顯；分生抱子典型的楠圓形，4. 5-5. 5X3. 0-4.Oum，壁平滑；分生 抱子鏈圓柱狀（見圖2)。
[0044] 2. 口SrDNA序列及同源性分析 W45] 提取內生青霉菌的基因組DNA，W提取到的DM為模板，PCR擴增真菌rDNA-ITS全 序列。PCR引物為上游引物口S1 :5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'(如沈化ID.NO. 3 所示）， 下游引物口S4 :5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'(如沈Q.ID.NO. 4 所示）；
[0046] PCR反應體系：12.加1Taqmix、模板DMΙ.ΟμΙ^、上下游引物各Ι.ΟμΙ^、d地2〇 9. 5μΙ。PCR反應條件：94°C預變性 3min;94°C變性Imin'src退火lmin，72°C延伸Imin， 循環34次；72°C后延伸10min，4°C保溫；利用引物口S1^TS4擴增得到的A1菌株口SrDNA 序列長度約為55化p(圖3)，符合常規的口SrDNA序列長度，測序序列長度為588bp，其口S rDNA序列如沈化ID.NO. 1所示。
[0047] 將內生青霉菌的的口SrDNA測序結果在GenBank數據庫中進行Blast比對，從結 果中選取10株與測定菌株序列相似性高的菌株進行系統發育分析，用Mega5. 05軟件采取 Nei曲bor-joining法構建系統進化樹（見圖4)。由圖可W看出，內生青霉菌與青霉屬的 遺傳進化距離最近，與已知菌株草酸青霉菌（PenicilliumoxalicumKF152942. 1)的口S rDNA同源性達到99%。結合其菌體形態和菌落特征觀察結果，將其鑒定為內生草酸青霉 Al(Pen