一種三維多孔微流控芯片及其制備方法與應用
【專利說明】一種三維多孔微流控芯片及其制備方法與應用
[0001]
技術領域
[0002]本發明屬于生物、化學及材料科學領域，具體涉及一種三維多孔微流控芯片及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0003]循環腫瘤細胞是由癌癥病灶脫落進入外周血的腫瘤細胞，循環腫瘤細胞的檢測對于腫瘤的早期診斷、個性化治療的評估、藥物評價以及手術預后等有重要意義。由于循環腫瘤細胞在血液中數目極少，對其分離造成了極大挑戰。當前亟待開發出簡單、高效、快速的分離循環腫瘤細胞的新方法。
[0004]微流控芯片是近年來發展迅速的技術，具有易集成、分析速度快、高通量、安全等優勢，在腫瘤標志物檢測、腫瘤細胞的分選、基因分析、藥物合成篩選、生物試劑檢測等領域有廣泛的應用。但是目前微流控芯片的制備大多步驟繁瑣、技術復雜、價格昂貴等，因此限制了其在生物醫學分析領域的應用。
【發明內容】
[0005]本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種三維多孔微流控芯片的制備方法及通過該方法得到的三維多孔微流控芯片。
[0006]本發明的另一目的在于提供一種三維多孔微流控檢測芯片的制備方法及通過該方法得到的三維多孔微流控檢測芯片。
[0007]本發明的再一目的在于提供所述三維多孔微流控芯片或檢測芯片的應用。
[0008]本發明的目的通過下述技術方案實現:
一種三維多孔微流控芯片的制備方法，包括如下步驟:
(1)將泡沫金屬先后放入有機溶劑、水中分別超聲清洗1-60分鐘。
[0009](2)將清洗后的泡沫金屬浸入到液體微流控芯片材料中，在1000-8000rpm的轉速下離心使微流控芯片材料充分浸潤泡沫金屬。
[0010](3)將浸潤了微流控芯片材料的泡沫金屬在1000-6000rpm的轉速下離心以除去泡沫金屬孔隙中的微流控芯片材料，之后將包被了微流控芯片材料的泡沫金屬加熱使微流控芯片材料固化。
[0011](4)將步驟(3)得到的微流控芯片材料包被的泡沫金屬浸入到5-14mol/L的酸性溶液中1-12小時以除去泡沫金屬，得到三維多孔材料。
[0012](5)將三維多孔材料Plasma處理1_5分鐘后浸入到濃度為1_50%的硅烷化試劑溶液中1-10小時，得到硅烷化試劑處理的三維多孔材料。
[0013](6)將硅烷化處理的三維多孔材料浸入到濃度為1-50%的溫敏材料溶液中，使溫敏材料充分浸潤多孔結構，變換溫度使溫敏材料凝固，得到溫敏材料封堵的三維多孔材料。
[0014](7)將步驟(6)得到的溫敏材料封堵的三維多孔材料放在潔凈的硅片上，倒入液體微流控芯片材料使其完全浸沒三維多孔材料，放置1-24小時使微流控芯片材料充分固化。
[0015](8)將覆蓋固化微流控芯片材料的三維多孔材料的部分切下，打孔器分別在兩端打進液口和出液口，Plasma處理1_5分鐘后與載玻片鍵合，得到溫敏材料封閉的微流控芯片。
[0016](9)改變步驟(8)得到的微流控芯片的溫度使溫敏材料溶解，通入超純水1-1000分鐘將溫敏材料沖洗干凈得到三維多孔微流控芯片。
[0017]步驟(1)中所述的泡沫金屬包括泡沫鎳、泡沫銅、泡沫招、泡沫合金等。
[0018]步驟(1)中所述的有機溶劑包括丙酮、甲苯、乙醇等。
[0019]步驟(2)中所述的微流控芯片材料包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、環烯烴共聚物樹脂(C0C)等。
[0020]步驟(4)中所述的酸性溶液包括硝酸、鹽酸、硫酸溶液等。
[0021]步驟(5)中所述的硅烷化試劑包括羧基乙基硅烷三醇鈉鹽、γ-氨丙基三乙氧基硅烷等可以在芯片表面衍生羧基、氨基等功能基團的硅烷化試劑等。
[0022]步驟(6)中所述的溫敏材料包括明膠、溫敏殼聚糖等。
[0023]一種三維多孔微流控芯片，通過上述方法制備得到。所述的三維多孔微流控芯片的尺寸可調，孔徑與泡沫金屬材料的孔徑相當。
[0024]一種三維多孔微流控檢測芯片的制備方法，包括如下步驟:將上述三維多孔微流控芯片用化學交聯劑活化后，通入1?500mg/mL的生物分子孵育0.5?10小時，再經PBS充分洗滌后得到生物分子修飾的三維多孔微流控芯片，即三維多孔微流控檢測芯片。
[0025]所述的生物分子優選為用于特異性識別和捕獲生物分子或細胞的蛋白或核酸，如抗體、鏈霉親和素、凝集素、生長因子、核酸適配體等。
[0026]一種三維多孔微流控檢測芯片，通過上述方法制備得到。
[0027]所述的三維多孔微流控芯片或三維多孔微流控檢測芯片在生物醫學分析中的應用，如血液中循環腫瘤細胞等特定細胞的分離、細胞外泌體的分離、游離RNA的分離、蛋白的分離等。
[0028]—種基于上述三維多孔微流控芯片分離血液中循環腫瘤細胞的方法，包括如下步驟:
(1)將含1-10%牛血清白蛋白和0.1-10%表面活性劑的溶液通入特異性識別和捕獲腫瘤細胞的生物分子(如抗體或者核酸適配體等)修飾的三維多孔微流控芯片中，孵育封閉l-1000min，之后 PBS 沖洗。
[0029](2)取癌癥病人的新鮮血液Ι-lOmL，以1-200 μ L/min的流速通入步驟(1)得到的生物分子修飾的三維多孔微流控芯片中，從而血液中的循環腫瘤細胞被所述生物分子捕獲。
[0030]步驟(1)中所述的表面活性劑包括吐溫、脫脂奶粉等。
[0031]本發明利用泡沫金屬作為犧牲模板復制出三維多孔的材料，再利用溫敏材料作為二次犧牲模板將三維多孔料整合到微流控芯片中，從而得到三維多孔微流控芯片。生物靶向分子通入交聯劑活化的三維多孔微流控芯片中固定在多孔材料表面，得到生物靶向分子功能化的三維多孔微流控檢測芯片，并將其成功用于循環腫瘤細胞的分離。
[0032]本發明具有如下優點和效果:
本發明制備的三維多孔微流控芯片具有多孔性、高透明性、強韌性、生物相容性好等優點。修飾了生物分子的三維多孔微流控檢測芯片，其三維多孔結構可以固定大量的生物分子，實現對待測物的高效率、高通量分離。本發明操作簡便易行、成本低、重復性好，在一般化學及生物化學實驗室均能完成。
【附圖說明】
[0033]圖1是泡沫鎳的掃描電鏡圖。
[0034]圖2是由泡沫鎳復制得到的三維多孔PDMS材料的掃描電鏡圖。
[0035]圖3是FITC標記的二抗表征抗上皮細胞粘附因子抗體修飾的三維多孔微流控檢測芯片的熒光顯微圖。
[0036]圖4是抗上皮細胞粘附因子抗體修飾的三維多孔微流控檢測芯片捕獲人乳腺癌細胞的熒光顯微圖。
[0037]圖5是血液通入到三維多孔微流控檢測芯片中的結構圖，1-固化的PDMS，2_三維多孔材料，3-進液口，4-出液口，5-載玻片，6-進液管，7-出液管。
[0038]圖6是抗上皮細胞粘附因子抗體修飾的三維多孔微流控檢測芯片從癌癥病人血樣中捕獲到的循環腫瘤細胞和白細胞的結果圖；其中，A、B、C、D為捕獲到的癌細胞，E、F、G、Η為白細胞，A、E為DAPI染色，B、F為CK-FITC染色，C、G為⑶45-PE染色，D、Η為前述三種染色的疊加圖。
【具體實施方式】
[0039]下面結合實施例及附圖對本發明做進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
[0040]若未特別說明，本說明書中涉及溶液的濃度均為質量分數。
[0041]實施例1
(1)將泡沫鎳(0.5mmX4mmX20mm)先后用丙酮、乙醇、超純水分別超聲清洗30分鐘，之后烘箱干燥。圖1為泡沫鎳的掃描電鏡照片，顯示其三維多孔的結構。
[0042](2)將干燥后的泡沫鎳浸入到裝滿未交聯的PDMS (聚二甲基硅氧烷)液體的2mL離心管中，8000rpm離心5分鐘使PDMS充分浸潤泡沫鎳。
[0043](3)將步驟(2)得到的PDMS浸潤的泡沫鎳轉移到空的2mL離心管中，3000rpm離心3分鐘以除掉泡沫鎳孔隙中的PDMS，之后80°C烘箱加熱3小時使PDMS固化。
[0044](4)將步驟(3)得到的PDMS包覆的泡沫鎳浸入到7mol/L的硝酸溶液中，刻蝕1小時以除掉鎳模板，再用超純水清洗掉殘留的硝酸溶液，得到三維多孔材料。圖2為三維多孔材料的掃描電鏡照片，顯示其完整的復制出了泡沫鎳的三維多孔結構。
[0045](5)將得到的三維多孔材料Plasma處理3分鐘后立刻浸入到含5%羧基乙基硅烷三醇鈉鹽的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，室溫下孵育4小時，再用超純水清洗多余的羧基乙基硅烷三醇鈉鹽的磷酸鹽緩沖液，得到羧基化的三維多孔材料。
[0046](6)將羧基化的三維多孔材料浸入到15%的明膠溶液中使其完全浸沒填充孔隙，取出三維多孔材料置于35°C以下待明膠凝固，得到明膠封堵的三維多孔材料。
[0047](7)將步驟(6)得到的明膠封堵的三維多孔材料轉移至潔凈的硅片表面，加入未交聯的PDMS液體使其完全淹沒覆蓋三維多孔材料，室溫下放置12小時使PDMS充分交聯固化。
[0048](8)將覆蓋固化PDMS的三維多孔材料的部分切下，打孔器在兩端分別打進液口和出液口，Plasma處理3分鐘后與載玻片鍵合，得到明膠封閉的微流控芯片。
[0049](9)將明膠封閉的微流控芯片加熱至50°C，以100 μ L/min的流速通入溫水(38°C左右)40分鐘充分沖洗掉殘余明膠，得到三維多孔微流控芯片。
[0050](10)將含有10mmol/L 1-(3-二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)和10mmol/L N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的混合溶液以50 μ L/min的流速通入三維多孔微流控芯片中活化30分鐘，之后以50 μ L/min的流速通入10 μ g/mL抗上皮細胞粘附因子抗體(eB1science