一種生產豬源脂聯素的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物制藥領域，具體講提供了一種生產豬源脂聯素的方法。
【背景技術】 W02] 脂肪組織（adiposetissue)主要由大量聚集成團的脂肪細胞構成，脂聯 素（Adiponectin/ADPN)是脂肪細胞分泌的一種內源性生物活性蛋白質。脂聯素是 一種膜島素增敏激素（AnInsulin-sensitizingHormone)，能改善小鼠的膜島素抗性 (Insulinresistance)和動脈硬化癥；對人體的研究發現，脂聯素水平能預示II型糖尿病 和冠屯、病的發展，并在臨床試驗表現出抗糖尿病、抗動脈粥樣和炎癥的潛力。
[0003] 在脂肪細胞分泌的具有生物活性的一類蛋白質因子中，脂聯素是脂肪組織基因表 達最豐富的蛋白質產物之一，大量存在于血液循環中。在人體內W3-30ug/ml的濃度出現 在循環血漿中。脂聯素又被稱作Ac巧30、apMl、AdipoQ、GBP28。最初，脂聯素是在人體皮 下脂肪組織、血漿和鼠科動物的脂肪細胞中被發現。人體內的脂聯素由244個氨基酸組成， 分子量為30邸，由氨基末端的分泌信號序列（aa1-18)，一段特異序列（aal9-41)，一組由 22個氨基酸組成的膠原重復序列（aa42-107)，一段球狀序列（aal08-244)組成。其中球 狀區是脂聯素生物活性的關鍵部位，和TNF-α的結構相似，脂聯素與膠原W、X和補體Clq 高度同源。脂聯素的單聚體和Ξ聚體是其生物活性形式或受體親和配基可W特異性結合骨 骼肌或肝臟細胞膜上的G蛋白截聯受體一型或二型脂聯素受體，進而調節脂肪酸氧化和糖 代謝。
[0004] 目前關于用基因工程的方法來表達生產脂聯素的報道還比較少。枯草芽抱桿菌具 有良好的分泌特性，其發酵工藝和產物回收技術也比較成熟，用作外源蛋白的分泌型宿主 菌，具有很大潛力。相關研究表明，多種外源蛋白都能在枯草芽抱桿菌中分泌表達，有些還 獲得了較高的產率。枯草芽抱桿菌WB700菌株是缺失7種胞外蛋白酶的枯草芽抱桿菌突變 株，其保外殘余的蛋白酶活性只相當于野生菌株的0. 1 %，是一種表達外源蛋白的理想宿主 困株。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種生產豬源脂聯素方法，W克服當前脂聯素在產業化應 用中產量不足的問題。目前還沒有用枯草芽抱桿菌WB700表達系統生物合成豬源脂聯素的 報道。枯草芽抱桿菌是一種原核單細胞微生物，具有培養條件易于控制、增殖速度迅速、表 達量高和表達產物易于分離純化等特點。
[0006] 本發明所提供的生產豬源脂聯素的方法包括W下步驟：
[0007] 1.可分泌表達sumo蛋白酶的操縱子、可分泌表達釀酒酵母小分子泛素樣蛋白與 豬源脂聯素融合蛋白的操縱子的合成：
[0008] a)人工合成含枯草芽抱桿菌麥芽糖誘導的Pglv啟動子、編碼枯草芽抱桿 菌果聚糖薦糖酶信號膚sacB和編碼sumo蛋白酶的表達操縱子基因的融合DNA片段 Pglv-sacB-ulpl(可W是由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成），其核巧酸序列為：
[0010] b)人工合成枯草芽抱桿菌高效啟動子P43、編碼枯草芽抱桿菌果聚糖薦糖酶信號 膚sacB和含編碼釀酒酵母小分子泛素樣蛋白與豬源脂聯素的融合蛋白表達操縱子基因的 融合DNA片段P43-sacB-sumol-adipo(可W是由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成），其 核巧酸序列為：
[0012] 2.豬源脂聯素母體基因可在枯草芽抱桿菌表達的載體pZLS-128的構建：
[0013] 將所述步驟a)中人工合成的基因片段Pglv-sacB-ulpl用BamHI和SacI雙酶切， 將所述步驟b)中人工合成的基因片段P43-sacB-sumol-adipo用BamHI和Bglll雙酶切， 依次構建入載體PGJ222,構建成命名為pZLS-128的質粒。
[0014] 3.重組表達載體pZLS-128在枯草芽抱桿菌WB700中的轉化：
[0015] 優選地，將枯草芽抱桿菌WB700感受態細胞與質粒pZLS-128混合并將混合物轉移 至2mm電轉杯，在2. 5kV、5mV條件下電擊；之后立即加入1000μ1預冷的枯草芽抱桿菌電轉 恢復培養基Μ，于37°C、22虹pm條件下恢復培養比；500化pm離屯、后將管底菌體均勻涂布 于含有Cm5的LB固體平皿上，培養皿放置于37Γ培養至單菌落出現；挑取單菌落置于LB液 體培養基振蕩培養被提取質粒進行EcoRI和SacI雙酶切鑒定和測序鑒定；將鑒定正確的單 菌落定義為BZLS128。
[0016] 4.重組枯草芽抱桿菌BZLS128菌株在搖瓶中的誘導表達：
[0017] 優選地，將篩選得到重組枯草芽抱桿菌BZLS128菌株的陽性轉化子接種到25ml的 LB液體培養基中，于30°C、225巧m的條件下振蕩培養8~1化至595皿波長處的吸光值 (0D595)達到2~4,之后加入5ml質量百分比濃度為30%的麥芽糖溶液進行誘導表達；接 著于25°C、225巧m的條件下再繼續振蕩培養36~4她，1200化pm離屯、10分鐘收集培養液 上清，即為獲得的豬源脂聯素蛋白。
[0018] 本發明人工設計合成包含有小分子泛素樣修飾物（smallubiquitin-related modifier,SUMO)蛋白酶W及豬源脂聯素蛋白與SUMO融合的雙順反子表達元件基因，W質 粒pZLS-128為大腸桿菌一枯草芽抱桿菌穿梭載體，構建了一個豬源脂聯素的重組枯草芽 抱桿菌WB700的表達系統。該系統具有優良的質粒穩定性，W及分泌表達的SUMO-脂聯素 蛋白偶合物能有效地被同樣分泌表達的SUMO蛋白酶水解從而釋放出具有正常生物學活性 的脂聯素。SUMO融合表達體系為枯草芽抱桿菌WB700菌株能夠分泌具有正常生物學活性所 對應的豬源脂聯素的構象提供了材料基礎。
[0019] 該系統解決了當前脂聯素產業化所面臨的一些關鍵問題：天然提取的脂聯素成本 太高，產業化困難：脂聯素分子量不大，在其它微生物表達體系下容易被降解或難W形成正 常生物學活性所對應的構象：分離純化工藝復雜等。
[0020] 本發明的有値結果為：
[0021] 1.表達系統簡單：本發明采用了豬源抗菌膚的重組枯草芽抱桿菌WB700表達體系 與SUMO融合表達體系，由于融合表達后得到的SUMO-脂聯素融合蛋白體不會對宿主菌枯 草芽抱桿菌WB700菌株產生毒害作用，因此可W使重組枯草芽抱桿菌WB700菌株持續表達 產物，而其生長則不會得到抑制。
[0022] 2.本發明可用于大規模生產：本發明采用枯草芽抱桿菌WB700表達體系，相對于 真核細胞表達系統和病毒表達系統具有生產條件和步驟簡單，反應條件易于控制的優點， 因此適用于大規模的的生產。
[0023] 3.生產成本低：本生產方法中的培養基價格低廉，生產所用設備為實驗室常規設 備，易于操作。
[0024] 4.生物活性強，無毒害物質：本發明分泌的蛋白質濃度高，生物活性強。
【附圖說明】： 陽ο巧]圖1為豬源脂聯素的Tris-SDS-PAGE分析 陽026] 其中，橫坐標表示的是蛋白電泳的泳道序號，縱坐標表示的是蛋白marker的分子 量大小：
[0027] 1 :蛋白marker:分子量（116. 0kDa、66. 2kDa、45. 0kDa、35.OkDa和 25.OkDa);
[0028] 2 :對照組：枯草芽抱桿菌WB700上清凍干樣品；
[0029] 3 :實驗組：重組枯草芽抱桿菌BZLS128上清凍干樣品。
【具體實施方式】 陽〇3〇]實施例1
[0031] 1.可分泌表達sumo蛋白酶的操縱子、可分泌表達釀酒酵母小分子泛素樣蛋白與 豬源脂聯素融合蛋白的操縱子的合成： W巧 a)人工合成含枯草芽抱桿菌麥芽糖誘導的Pglv啟動子、編碼枯草芽抱桿 菌果聚糖薦糖酶信號膚sacB和編碼sumo蛋白酶的表達操縱子基因的融合DNA片段Pglv-sacB-ulpl(可W是由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成），其核巧酸序列為：
[0034]b)人工合成枯草芽抱桿菌高效啟動子P43、編碼枯草芽抱桿菌果聚糖薦糖酶信號 膚sacB和含編碼釀酒酵母小分子泛素樣蛋白與豬源脂聯素的融合蛋白表達操縱子基因的 融合DNA片段P43-sacB-sumol-adipo(可W是由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成），其 核巧酸序列為：
[0036] 2.豬源脂聯素母體基因可在枯草芽抱桿菌表達的載體pZLS-128的構建：
[0037] 將所述步驟a)中人工合成的基因片段Pglv-sacB-ulpl用BamHI和SacI雙酶切， 將所述步驟b)中人工合成的基因片段P43-sacB-sumol-adipo用BamHI和Bglll雙酶切， 依次構建入載體PGJ222,構建成命名為pZLS-128的質粒。
[0038] 3.重組表達載體pZLS-128在枯草芽抱桿菌WB700中的轉化：
[0039] 將枯草芽抱桿菌WB700感受態細胞與質粒pZLS-128混合并將混合物轉移至2mm 電轉杯，在2. 5kV、5mV條件下電擊；之后立即加入1000μ1預冷的枯草芽抱桿菌電轉恢復培 養基RM，于37°C、225巧m條件下恢復培養比；500化pm離屯、后將管底菌體均勻涂布于含有 Cm5的LB固體平皿上，培養皿放置于37°C培養至單菌落出現；挑取單菌落置于LB液體培養 基振蕩培養被提取質粒進行EcoRI和SacI雙酶切鑒定和測序鑒定；將鑒定正確的單菌落定 義為BZLS128。
[0040] 4.重組枯草芽抱桿菌BZLS128菌株在搖瓶中的誘導表達：
[0041] 將篩選得到重組枯草芽抱桿菌BZLS128菌株的陽性轉化子接種到25ml的LB液體 培養基中，于30°C、225巧m的條件下振蕩培養8~1化至595nm波長處的吸光值（0D595)達 到2~4,之后加入5ml質量百分比濃度為30%的麥芽糖溶液進行誘導表達；接著于25°C、 225巧m的條件下再繼續振蕩培養36~4她，1200化pm離屯、10分鐘收集培養液上清，即為獲 得的豬源脂聯素蛋白。 柳42] 實施例2
[0043] 重組枯草芽抱桿菌BZLS128菌株分泌豬源脂聯素的Tris-SDS-PAGE鑒定：
[0044] 枯草芽抱桿菌WB700菌株和重組枯草芽抱桿菌BZLS128菌株的發酵液上清經過冷 凍干燥后，使用Tri s-SDS-PAGE方法進行蛋白電泳分析及濃度比定。
[0045] 1. Tris-SDS-PAGE聚丙締酷胺凝膠（分離膠+濃縮膠）制備
[0046]
[0047] 2.相關試劑的制備 W48]a) 30 %聚丙締酷胺：丙締酷胺29g和Ig甲叉雙丙締酷胺溶于100血d地2〇中；
[0049] b) 1XSDS凝膠上樣緩沖液：50mmol/LTris-肥 1(Ph6. 8)，lOOmmol/L二硫蘇糖醇 (臨用時加入），2 % (m/V)SDS(電泳級），0. 1 %漠酪藍和10 % (V/V)甘油；
[0050] C) 1XTris-甘氨酸電泳緩沖液：25mmol/LTris，250mmol/L甘氨酸（電泳級）（pH 8. 3)，0. 1 % (m/V)SDS;(可配成5X膽存液，在900血去離子水中溶解15.IgTris堿和94g 甘氨酸，然后加入50血10% (m/V)電泳級SDS膽存液，用去離子水補至1000血即可）
[0051] d)憐酸緩沖液（PB巧：Na化 137mmol/L，KC1 2. 7mmol/L，Na2HP0410mmol/L， KH2P042mmol/L； 陽05引 e)染色液：25%異丙醇，10%乙酸和0. 04% (g/mU考馬斯亮藍R-250 ;
[0053]f)脫色液：5 %乙酸和7. 5 %甲醇；
[0054]g)200mg/mlIPTG:在8ml去離子水中溶解 2gIPTG，定溶至 10ml，用 0. 22μπι滅菌 濾器過濾除菌，分裝成1ml小份，膽存于-20°C; 陽化日]h) 10%十二烷基硫酸鋼（SDS):在900ml去離子水中溶解lOOg電泳級SDS，加熱至 68°C助溶，加入幾滴濃肥1調節溶液的抑值至7. 2,加水定容至1000ml，分裝備用；
[0056] i) 10%過硫酸錠：稱取Ig過硫酸錠溶于10血蒸饋水中；
[0057]j)1.5mol/LTris(p冊.8):在 800ml去離子水中溶解 181.65gTris堿，定溶至 1000血，用濃鹽酸調節抑值至8. 8 ;
[0058]k)1.5mol/LTris(p冊.8):在 800ml去離子水中溶解 181.65gTris堿，定溶至 1000血，用濃鹽酸調節抑值至6. 8 ;
[0059] 1)Imol/L二硫蘇糖醇值TT):用 20ml0.Olmol/L乙酸鋼溶液（pH:5.。溶解3. 09g DTT，過濾除菌后分裝成1血小份，膽存于-20°C。 W60]