使用拼裝序列擴增片段化的目標核酸的方法
【專利說明】使用拼裝序列擴增片段化的目標核酸的方法
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請是申請日為2013年3月15日、申請號為61/789，984的臨時專利申請的非臨時專利申請。
[0003]關于聯邦研究或發展資助的申明
[0004]無
[0005]以光盤形式提交的相關參考資料
[0006]無
[0007]發明背景
[0008](1)本發明的領域
[0009]本發明涉及擴增一含有短核酸片段的片段化的目標核酸的方法。具體地，使用一拼裝模板拼裝和延伸這些短核酸以產生用于進一步操作的更大的擴增子。
[0010](2)【背景技術】描述
[0011]有許多樣本類型的目標核酸被嚴重降解，導致標準分子的診斷試驗難以檢測目標核酸。更具體地，這些目標核酸比所述用于檢測它們的試驗的“足跡”更短。譬如，為了檢測一拷貝數非常低的目標，一般會擴增所述目標。另外，在許多情況下，會期望高度特異地檢測所述目標。這一檢測常常在一單核苷酸變化的分辨率上。實行擴增時，如PCR反應，存在一正向引物、一反向引物和一檢測探針。通常地，這些引物和所述檢測探針至少在長度上約為20個核苷酸。假設所述引物和探針不存在部分重疊，那么要求所述目標至少在長度上為60個核苷酸以容納這三個原件(即所述試驗的足跡)的結合。而且，所述將被檢測的期望的單核苷酸變化(SNV)可發生于所述目標核酸序列的任何位置。為了可靠地檢測，所述單核酸變化必須定位在所述擴增的目標核酸之中(即在所述引物結合位點之內的所述擴增子的一區域之內)以使所述探針選擇性地與該區域雜交。這有效地增加所述試驗的所述潛在足跡到至少約100核苷酸的長度以用于該種檢測。
[0012]在很多情況下，檢測一在所述目標序列中的已知或未知的SNV要求進行所述檢測的片段長達160個核苷酸。這在很大程度上歸因于探針、引物和封閉探針在所述擴增子上的排列。
[0013]這一需求的挑戰在于許多樣本類型含有短至20-50個核苷酸長度的片段，通常歸因于所述目標DNA或RNA的部分降解。這在RNA序列中是典型的，因為它們更容易降解。這也常見于特殊的樣本類型，如尿液、血液樣本，和進行甲醛固定石蠟包埋(FFPE)的、細針抽吸(FNA)的樣本，其中交聯的核酸隨著儲存變得降解程度更大。在尿液的情況下，由于通過腎臟的處理，核酸天生的以小片段的形式進入尿液。通常地，穿過所述腎臟的核酸片段的大小約為20-50個核苷酸或更小。
[0014]因此，需要延伸短目標片段的長度以進行更為有效率和準確的檢測。這需要所述被擴大的目標短片段具有與所述短片段原始來源的序列具有相同的序列背景以使得進行適當的處理成為可能。本發明提供了方法以實現這一需要。發明概要
[0015]本發明提供了使用拼裝模板擴增一片段化的目標核酸的方法，所述拼裝模板結合并延伸一目標核酸的短核酸片段以產生更大的擴增子來進行進一步操作。本發明的一方面是一擴增一含有短目標核酸片段的片段化的目標核酸的方法，因為其長度原因難以使用現有的技術擴增。在一實施方案中，所述片段化的目標核酸與一含有一與所述目標核酸基本上互補、卻有顯著不同的序列的拼裝序列混合。一群短目標核酸片段退火與所述拼裝序列結合，所述短目標核酸片段通過聚合酶在3’方向延伸以產生一群含有一群第一核酸和所述拼裝序列的第一雙重核酸。
[0016]所述一群第一雙重核酸從所述拼裝序列解離，所述一群第一核酸退火與一含有一與所述拼裝引物的一區域相同的序列的第一引物結合，所述第一引物位于待檢目標區域的5’端(拼裝序列的同義鏈)。在一些情況下，所述引物位點恰好位于所述拼裝序列的5’末端。所述引物向其3’端方向衍生一產生一群第二核酸。所述第一和第二核酸解離并又退火與所述拼裝序列及自身之間相結合，并通過聚合酶分別向其3’端延伸。重復該步驟，從而在由所述拼裝序列的5’端的所述第一引物與同所述拼裝序列最接近3’端的大部分區域互補的所述目標核酸片段所產生的邊界內延伸并線性擴增所述短片段化的目標核酸。
[0017]在第二方面，一旦實現了拼裝，所述方法進一步包括，在所述拼裝序列存在時通過使用能夠檢測罕見的遺傳事件實驗方法對所述目標序列特異性的基因變體的檢測。
[0018]在一實施方案中所述拼裝序列是一野生型拼裝序列。
[0019]在第二實施方案中，所述拼裝序列是基因組DNA或其特異于所述所關注的目標的一部分。在一些實施方案中，所述基因組DNA或其部分是人基因組DNA。在另一些實施方案中，所述基因組DNA或其部分與特定的生物體如病毒、細菌、寄生蟲和真菌有關。
[0020]在第三實施方案中，所述拼裝序列可為所述目標核酸序列的一片段和/或其他任意的但是已知的序列。
[0021]在第四實施方案中，所述拼裝序列含有突變體和野生型序列的基因變異。在該應用中，一旦經過拼裝，突變體(遺傳變異序列)或野生型序列就可以用下游的分析方法在一相對于所述拼裝序列的野生型序列與一相對于所述拼裝序列的基因變異存在時被確定。同樣，在平行反應中野生型和基因變異的拷貝的普遍程度和/或拷貝數能夠被確定。
[0022]在所有情況下，所述拼裝序列被設計為通過3’端延伸擴大所述目標核酸的短核酸片段以檢測一目標核酸的一區域。
[0023]在第六實施方案中，所述拼裝序列是雙鏈的。
[0024]在第七實施方案中，同時使用正向引物和反向引物在PCR條件下進行所述拼裝。
[0025]在第八實施方案中，多重線性擴增循環被用于線性地拼裝短核酸片段，而不會發生在同時存在正向引物和反向引物時，所述拼裝序列在指數擴增條件下擴增。
[0026]在第九實施方案中，拼裝在更低的溫度下進行以幫助短核酸與所述拼裝序列雜交，一旦發生拼裝，所述擴增溫度可被升高，并可添加其他試劑以支持指數擴增。
[0027]在第十實施方案中，進行兩個拼裝反應，一個反應使用一所關注的檢測區域3’端的引物，另一個則使用一所關注的檢測區域的5’端的引物。一旦在所述兩個分開的反應混合物中發生拼裝，可以將它們結合用正向和反向引物進行指數擴增。
[0028]在第十一實施方案中，當所述片段化的核酸濃度更高時，所述拼裝反應可與聚合酶鏈式反應(PCR)同時進行。
[0029]在另一實施方案中，所述拼裝序列超過所述用于拼裝的核酸片段預期濃度的10、100、1000、10000 或 100000 倍。
[0030]本發明的其他方面參見于所述說明書的全文中。
[0031]圖片簡述
[0032]圖1是本發明中一個方面的示意圖。
[0033]除非另有說明，此處所用的所有術語都與本發明所屬的本領域技術人員所通常理解的含義相同。此處公開全文所引用的所有專利、專利申請和出版物都以它們全文的形式被引用。若此處的某一術語含有多重的定義，則以本部分最通常的定義為準。
[0034]此處所用術語“寡核苷酸”指核苷酸的一聚合物形式，核糖核苷酸或脫氧核糖核酸，含有天然或非天然的核苷酸，長度至少為2，通常在約5至約200，或者更常見地至約100。因此，該術語包含雙鏈和單鏈DNA和RNA。此外，寡核苷酸可抗核酸酶，包括但不限于2’ -0-甲基核糖核苷酸、硫代核苷酸、二硫代核苷酸、磷酰胺核苷酸和甲基膦酸酯核苷酸。
[0035]此處所用術語“目標”、“目標序列”或者“目標核苷酸”指一含有一所關注的多聚核苷酸的核酸，需要對其進行純