固定化的脯氨酸特異性內切蛋白酶的制作方法
【專利說明】固定化的脯氨酸特異性內切蛋白酶
[0001] 本發明涉及固定化的脯氨酸特異性內切蛋白酶和其中使用固定化的脯氨酸特異 性內切蛋白酶的啤酒制備方法。
[0002] 背景
[0003] 脯氨酸特異性內切蛋白酶是可源自細菌和真菌的酶；例如如W02002/046381中所 公開的來自Aspergillus niger的脯氨酸特異性內切蛋白酶。脯氨酸特異性內切蛋白酶能 夠在蛋白鏈中包含脯氨酰基-殘基的位置切割蛋白。W02002/046381公開了 ：所述脯氨酸 特異性內切蛋白酶可被用于減少飲料例如啤酒中的混濁（haze)。啤酒中的混濁主要由蛋白 質-多酚聚集體組成。為了減少混濁，可在發酵期間或在啤酒的穩定化期期間，將脯氨酸特 異性內切蛋白酶加入到麥芽汁中。
[0004] W02005/027953公開了：當在漿化（mashing)或啤酒發酵期間加入脯氨酸特異性 內切蛋白酶時，脯氨酸特異性內切蛋白酶降低了啤酒中的谷蛋白水平。
[0005] 為了能夠在例如啤酒生產過程中重復使用脯氨酸特異性內切蛋白酶， W02003/104382中建議：使酶固定化并使酶殘存在終產物中的風險最小化。
[0006] 幾十年前就已知了酶的固定化（參見"Immobilization of Enzyme and Cells"， 第二版，Jose M.Guisan編，2006, Humana Press Inc.)。最常見的酶固定化程序是共價偶 聯、包埋、微囊化和交聯。
[0007]然而，尚未公開用于脯氨酸特異性內切蛋白酶的合適的固定化，其中酶在部分或 全部不溶的底物上保持活性，所述底物例如是在啤酒中形成混濁的蛋白質-多酚聚集體或 者谷蛋白。
[0008] 本發明的目標是在不溶性底物上有充分的活性的固定化的脯氨酸特異性內切蛋 白酶。
[0009]
[0010] 本公開涉及固定在載體上的固定化的脯氨酸特異性內切蛋白酶，所述載體包含粒 徑范圍為100-400 μπι的氨基官能化的甲基丙烯酸酯。出乎意料地，已發現：本文所公開的 固定化的脯氨酸特異性內切蛋白酶不僅在大的底物例如谷蛋白上保持其酶活性，而且在較 低的溫度下顯示出比游離酶在該較低溫度下的相對活性更高的相對活性。
[0011] 本公開還涉及生產固定化的脯氨酸特異性內切蛋白酶的方法，所述方法包括：用 雙官能交聯劑激活氨基官能化的甲基丙烯酸酯載體中的氨基基團，以〇. 01-0. 07重量/重 量的酶：載體比率使氨基官能化的甲基丙烯酸酯載體上的脯氨酸特異性內切蛋白酶固定 化，以及生產固定化的脯氨酸特異性內切蛋白酶。
[0012] 本公開還涉及生產啤酒的方法，所述方法包括：制備漿體、發酵啤酒和使啤酒穩定 化，其中將所述啤酒與固定化的脯氨酸特異性內切蛋白酶一起孵育。
[0013] 詳細說明
[0014] 本文公開了固定在載體上的固定化的脯氨酸特異性內切蛋白酶，所述載體包含氨 基官能化的甲基丙烯酸酯聚合物。優選地，固定化的脯氨酸特異性內切蛋白酶的粒徑范 圍為100-400 μπι。優選地，包含氨基官能化的甲基丙稀酸酯聚合物的載體的粒徑范圍為 150-350 μ m之間。優選地，甲基丙烯酸酯聚合物已用二亞甲基氨基官能化。
[0015] 有利地，本文所公開的固定化的脯氨酸特異性內切蛋白酶被固定在孔徑分布d50 為1500 - 2100A、例如孔徑分布d5〇為1600 - 2000A的載體上。孔徑分布d50是本領 域技術人員已知的術語，其被定義為累積分布中50%的孔直徑的值。
[0016] 通常，用于固定化脯氨酸特異性內切蛋白酶的氨基官能化的甲基丙烯酸酯載體的 表面積大于40m 2/g，例如大于45m2/g，或者大于50m2/g。用于固定化脯氨酸特異性內切蛋白 酶的甲基丙烯酸酯載體的保水性通常為58-70 %，例如60-68 %，或者62-66 %。保水性在本 文中被定義為完全水化的載體的重量和完全干燥的載體的重量之間的比率。
[0017] 出乎意料地，已發現：本文所公開的固定在載體上的脯氨酸特異性內切蛋白酶不 僅在大的聚合底物和/或蛋白質-多酚聚集底物例如混濁（例如啤酒混濁）上保持活性， 而且還能夠水解谷蛋白，例如大麥谷蛋白。
[0018] 本文所公開的固定在載體上的具有脯氨酸特異性內切蛋白酶活性的酶可以是能 夠在蛋白質或肽鏈中包含脯氨酰基-殘基的位置切割肽或蛋白質的任何合適的酶。脯氨 酸特異性內切蛋白酶可源自細菌或真菌來源，例如源自Flavobacterium、Sphingomonas、 Aeromonas、Xanthomonas、Bacteroides、Aspergillus 或 Penicillium 屬，例如源自 Flavobacterium meningosepticum、Sphingomonas capsulata、Aspergillus niger 或 Penicillium chrysogenum。本文所公開的脯氨酸特異性內切蛋白酶屬于酶分類EC 3. 4. 21. 26。脯氨酸特異性內切蛋白酶優選地是這樣的酶，其水解脯氨酸殘基的羧基末端的 肽鍵，從而產生具有C-末端脯氨酸的肽和/或多肽片段。
[0019] 詞語"固定化的"在本文中用于表示酶附著在載體（例如甲基丙烯酸酯載體）上。 可通過酶吸附、包埋或交聯在載體上或酶吸附、包埋或交聯到載體上來實現酶的固定化，這 是本領域技術人員已知的（參見"Immobilization of Enzyme and Cells"，第二版，Jose M. Guisan 編，2006, Humana Press Inc.) 〇
[0020] 本公開提供通過交聯固定在甲基丙烯酸酯載體上的脯氨酸特異性內切蛋白酶。
[0021] 在一個實施方式中，本公開涉及生產本文所公開的固定化的脯氨酸特異性內切蛋 白酶的方法，所述方法包括：用雙官能交聯劑激活氨基官能化的甲基丙烯酸酯載體中的氨 基基團，將脯氨酸特異性內切蛋白酶固定在載體上以及生產固定化的脯氨酸特異性內切蛋 白酶。
[0022] 出乎意料地，已發現：使用本文所公開的固定化的脯氨酸特異性內切蛋白酶的方 法將產生固定化的脯氨酸特異性內切蛋白酶，其在較低的溫度下具有比游離酶的相對活性 更高的相對活性。
[0023] 甲基丙烯酸酯載體可以用例如二亞甲基間隔（spacer)或六亞甲基間隔（優選六 亞甲基間隔）進行氨基官能化。
[0024] 通過雙官能交聯劑激活氨基官能化的甲基丙烯酸酯中的氨基基團導致酶被固定 到載體上。優選地，交聯劑是戊二醛。可以以本領域技術人員已知的任何合適方式用戊二 醛激活氨基基團。
[0025] 在將酶固定到載體上期間，可應用任何合適的酶：載體比率，例如0. 01-0. 07重量 /重量的比率，或者〇. 02-0. 06重量/重量的酶：載體比率，或者0. 03-0. 05重量/重量的 酶：載體比率。已發現：在本文所公開的固定化方法中，在所指出的酶：載體比率下，獲得了 在甲基丙烯酸酯載體上的固定化的脯氨酸特異性內切蛋白酶，所述酶具有比得上游離酶的 活性。
[0026] 優選地，本文所公開的用于固定脯氨酸特異性內切蛋白酶的方法在10°C -50°C， 例如15°C -40°C之間，例如20°C -30°C之間的溫度下進行。
[0027] 本文所公開的用于固定脯氨酸特異性內切蛋白酶的方法可在任何合適的pH下進 行，例如6-8之間的pH或者6. 7-7. 5之間的pH。可使用將pH維持在期望水平的任何緩沖液， 例如具有在20-150mM之間，或者在40-120mM之間，或者在60-100mM之間，例如在70-90mM 之間的鹽濃度的緩沖液。合適的緩沖液可以例如是磷酸鹽緩沖液。
[0028] 本文所公開的用于固定化脯氨酸特異性內切蛋白酶的方法可進行4-48小時，例 如8-36小時或者10-24小時。
[0029] 在一個實施方式中，本公開涉及本文所公開的固定化的脯氨酸特異性內切蛋白酶 用于水解谷蛋白（例如大麥谷蛋白）的用途。
[0030] 谷蛋白是在小麥、黑麥、大麥和燕麥中發現的一組富含脯氨酸和谷氨酰胺的蛋白， 其可被細分為麥谷蛋白和醇溶谷蛋白。僅谷蛋白的醇溶谷蛋白級分使谷蛋白不耐受人群和 /或患乳糜瀉的人群產生過敏反應。不同谷物中的醇溶谷蛋白通常在小麥中被表示為小麥 醇溶蛋白、在大麥中被表不為大麥醇溶蛋白、在黑麥中被表不為黑麥醇溶蛋白、在燕麥中被 表示為燕麥醇溶蛋白。為了實現本公開的目的，詞語"小麥醇溶蛋白"可被用于表示所有不