鱗片脫落疾病(sdd)致病病毒及其衍生物的制作方法
【專利說明】鱗片脫落疾病（SDD)致病病毒及其衍生物
[0001] 本發明涉及分離的造成魚的鱗片脫落疾病的病毒，涉及包含所述病毒的細胞培養 物，涉及基于所述病毒的疫苗和這樣的疫苗的制備方法，涉及與所述病毒反應的抗體，涉及 用于檢測該病毒的診斷測試試劑盒，和涉及所述病毒的用途。
[0002] 在過去的數十年中，全世界范圍可見魚類消耗的劇烈增加。這同樣關于冷水魚(諸 如鮭魚、比目魚、大比目魚和鱈魚）以及熱帶魚(諸如亞洲海鱸（尖吻鱸）、羅非魚、遮目魚、 黃尾魚、琥珀魚、石斑魚和軍曹魚）的消耗。因此，見到養魚場的數目和大小的增加，以便滿 足日益增加的市場需要。
[0003] 如由例如畜牧業已知的，緊密生活在一起的大量動物易受各種各樣的疾病影響， 甚至是幾乎不知道或沒見過的疾病，或甚至是在大規模商業養殖期之前未知的疾病。這對 于魚類養殖同樣適用。
[0004] 近年來，在養殖的亞洲海解（?盧魚（ZaiescaJcari/kr))中發現了一種新疾病綜 合征。該疾病的最顯著特征在于鱗片脫落，并因此經常被稱作"鱗片脫落綜合征"(SDS)。在 馬來西亞檳榔嶼（Penang)養殖的亞洲海鱸中首次報道了該疾病。以后發現該新疾病的爆 發也在2002年、2006年和2009年發生在新加坡。更近的病例于2010年報道自印度尼西亞 Bantam的養魚場和再次來自新加坡，以及在2011年也來自StraitsofMalaka的養魚場。 該疾病的發病率當前正在增加。
[0005]Gibson-Kueh,S.，等人（JournalofFishDiseases35; 19-27 (2012))最近 描述了該疾病綜合征。
[0006] 該疾病最初見于成年籠養魚中，且也見于苗圃的魚苗中。死亡率被描述為慢性的、 拖延的，且在最初的30%至總體的75%之間變化。
[0007] 遭受該綜合征的魚的主要臨床征象首先是如上所述的鱗片脫落、昏睡行為和有時 腫大的眼睛。魚有時也顯示出神經學征象：一些受影響的魚顯示出螺旋游泳，可能是由于腦 中的血管損傷，其導致多病灶腦軟化。
[0008] 主要組織學征象具體地是所有重要器官(包括皮膚）中的血管內皮變性（血管 炎）。該血管炎導致組織壞死，其也影響胃腺、脾、腎和心臟。也如Gibson-Kueh所述，覆蓋 鱗片床的真皮經常是壞死的，且與鱗片脫落有關。
[0009] 但是，沒有發現該疾病的成因。Gibson-Kueh聲稱，病魚中的組織病理學以及在 組織中觀察到的大六角形病毒粒子和小得多的六角形病毒粒子可能提示病毒病原學的 可能性，但是她的結論是，總體上，在檢查的組織中的病毒粒子數目較低。基于大小和形 態學，一些觀察的病毒粒子類似于虹彩病毒，但是使用抗-真鯛虹彩病毒（RedSeabream Iridovirus，RSIV)單克隆抗體M10(Nakajima,Κ·等人，FishPathology30: 115-119 (1995))的免疫組織化學給出了陰性結果。
[0010] 使用已知靶向大范圍的已知虹彩病毒的RSIV引物的PCR測試也給出了陰性結果。
[0011] 通過使魚組織與藍仿石自盧（/&67??^〇/7scii/TiAs·Shaw) (GF)細胞和亞洲海自盧細胞 接觸來分離病毒的嘗試（Chong，S.等人，SingaporeVet.J.1; 78-89 (1987))也沒有成 功。
[0012] 鑒于觀察到的非常低數目的病毒樣顆粒，Gibson-Kueh提示，該疾病可能是對病毒 抗原的免疫超敏反應的結果，而不是由病毒造成。例如，提示這樣的反應是鮭魚（salmonid) 的草莓病的成因。
[0013] 除此以外，血管炎和有關的壞死(其為SDS的標志）對于虹膜疾病并不是通常的。
[0014] 此外，在SDS中看到的病變在幾個方面不同于在虹彩病毒疾病中看到的病變。
[0015] 盡管有上述的嘗試，沒有發現病毒起源，且甚至沒有發現病毒涉入的證據，該事實 將Gibson-Kueh引導至低數目的不同病毒的存在的以下解釋："病毒樣顆粒相對難以發現。 此外，全身性虹彩病毒疾病現是Z.cahari/ei#魚場中的地方流行病，所以它們的存在可 以是共同病原體的偶然發現"。
[0016] 因為這些原因，該疾病的病原體直到現在仍然完全不明。
[0017] 本發明的一個目的是，提供該疾病的病原體以及以戰勝該疾病為目標的疫苗。此 外，本發明的一個目的是，提供檢測和鑒別所述病原體的裝置。
[0018] 現在已經確定，該疾病的病原體是具有約140nm直徑的二十面體病毒。
[0019] 發現該病毒屬于雙鏈DNA病毒，且現在已經確定該病毒的DNA序列的大部分。
[0020] 該新病毒的序列與基因組數據庫中的其它序列的對比意外地揭示，在核苷酸水 平，該病毒與虹膜病毒科（/riobKirii/ae)的病毒具有特定盡管低的相似性水平，所述虹膜 病毒科是具有二十面體形狀、具有120-350nm之間的大小且具有雙鏈基因組的病毒科。
[0021] 由于現在已經鑒別出該疾病的病原體，該疾病在描述中不再被稱作鱗片脫落綜合 征，而是被稱作鱗片脫落疾病（SDD) (#義》)。
[0022] 該病毒的代表已經在登錄號CNCM1-4754下保藏在CollectionNationalede CulturesdeMicroorganisms(CNCM),InstitutPasteur, 25RueduDocteurRoux, F-75724ParisCedex15，France〇
[0023] 基于序列對比，可以鑒別編碼主要衣殼蛋白的基因和編碼該病毒的ATP酶的基 因，其與已知的虹膜病毒科具有某種相似性。
[0024] 編碼主要衣殼蛋白的基因和編碼ATP酶的基因的DNA序列的例子分別描述在SEQ IDNO: 1和SEQIDN0: 3中。SEQIDN0: 2代表主要衣殼蛋白的氨基酸序列。SEQID NO: 4代表ATP酶的氨基酸序列。
[0025] 虹膜病毒科目前包括5個屬：蛙病毒屬（Ranaviruses)、腫大細胞病毒 (Megalocytiviruses)、淋巴囊腫病毒屬（Lymphocystiviruses)、綠虹彩病毒屬 (Chloriridoviruses)和虹彩病毒屬（Iridoviruses)(JunKurita和KazuhiroNakajima， Viruses4; 521-538 (2012))〇
[0026]Kurita和Nakajima的論文具體地顯示了 5個屬的共計20個已知種的系統樹中的 5個屬的概要（另外，添加了 3個囊泡病毒同系物作為外群體）。該系統樹給出了不同種的 相互親緣關系/距離的指示，并且使為什么將這些病毒中的每一種歸類為5個屬之一的成 員形象化。
[0027] 基于根據本發明新發現的SDD病原體的MCP和ATP酶編碼DNA序列，可以做出新 的系統樹(基于鄰接方法)，且發現編碼序列中的MCP和ATP顯示與虹膜病毒科的系統樹的 某種匹配。
[0028] 使用程序MEGA，第5版，使用標準設置，制作這些樹（MEGA5:Molecular EvolutionaryGeneticsAnalysisUsingMaximumLikelihood,EvolutionaryDistance,andMaximumParsimonyMethods.錦趣chiroTamura,DanielPeterson,Nicholas Peterson,GlenStecher,MasatoshiNei和SudhirKumar.Mol.Biol.Evol. 28 (10): 2731-2739.2011doi:10.1093/molbev/msrl21AdvanceAccesspublication，2011年5月 4曰）。
[0029] 基于該新病毒的二十面體形狀、120-350nm之間的基因組大小和雙鏈基因組，且 基于主要衣殼蛋白鄰接樹(使用MEGA5得到，其具有指示推論的分支模式的穩健性的統計 支持，如使用自舉測試評估的)，發明人認為該病毒是虹膜病毒科的一個成員。
[0030] 基于MCP序列的樹描繪在圖8中。基于ATP酶序列的樹描繪在圖9中。
[0031] 非常令人驚奇的是，基于它與5個已知屬的距離，新發現的SDD的病原體似乎沒有 匹配5個屬中的任一個，如從圖8可以容易地看出的。
[0032] 因而，基于它的主要衣殼蛋白和它的ATP酶的編碼DNA序列，可以特別地將該病毒 與虹膜病毒科的已知成員區分開。
[0033] 經證實，根據本發明的病毒的主要衣殼蛋白與甚至虹膜病毒科的其它種中的最接 近的MCP具有僅65%的序列同一性水平。
[0034] ATP酶與虹膜病毒科的其它種的最接近的ATP酶具有僅68%的序列同一性水平。
[0035] 使用主要衣殼蛋白和ATP酶編碼DNA序列，開發了對根據本發明的病毒特異性的 引物。
[0036] SEQIDNO: 1顯示了編碼根據本發明的病毒的主要衣殼蛋白的基因的核苷酸序 列的通常例子。
[0037] 應該理解，對于本文中包括的具體蛋白而言，天然變異可以存在于所述病原體的 各個代表之間。導致例如主要衣殼蛋白序列中的微小變化的遺傳變異確實存在。這對于ATP 酶而言同樣適用。首先，存在所謂的"第二和第三堿基中的搖擺"，其解釋了核苷酸變化可 能發生，其在它們編碼的氨基酸序列中不引人注意：例如三聯體TTA、TTG、TCA、TCT、TCG和 TCC都編碼亮氨酸。另外，可以在氨基酸序列中看到根據本發明的SDD病毒的代表之間的微 小變異。這些變異可以由整個序列中的一個或多個氨基酸差異反映，或由所述序列中的一 個或多個氨基酸的缺失、置換、插入、倒位或添加反映。已經描述了基本上不會改變生物活 性和免疫學活性的氨基酸置換，例如Neurath等人在"TheProteins"AcademicPressNew York(1979)中。有關的氨基酸之間的氨基酸置換或在進化中已經頻繁發生的替換尤其是 Ser/Ala、Ser/Gly、Asp/Gly、Asp/Asn、Ile/Val(參見Dayhof，M.D. ,Atlasofprotein sequenceandstructure,Nat.Biomed.Res.Found. ,WashingtonD.C. , 1978,第 5 卷， 增刊 3)。其它氨基酸置換包括Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、 Th;r/Phe、Ala/P;ro、Lys/A;rg、Leu/Ile、Leu/Val和Ala/Glu。基于該信息，Lipman和Pearson 開發了一種用于快速和靈敏的蛋白對比（Science227，1435-1441，1985)以及確定同源 蛋白之間的功能相似性的方法。本發明的示例性實施方案的這類氨基酸置換以及具有缺失 和/或插入的變異是在本發明范圍內。
[0038] 這解釋了為什么MCP和ATP酶（當分離自根據本發明的SDD病毒的不同代表時)可 能具有顯著低于100%的同源性水平，但是仍然代表SDD病毒(鱗片脫落疾病的病原體）的 MCP或ATP酶。
[0039] 這明顯地反映在例如Kurita和Nakajima的論文的圖4中，其中表明，即使在由高 度相關的淋巴囊腫疾病病毒（LCDV)組成的淋巴細胞病毒屬內，所有LCDV仍然具有顯著不 同的MCP氨基酸序列。
[0040] 因而，本發明的第一個實施方案涉及一種分離的病毒，其是包含MCP基因和ATP酶 基因的虹膜病毒科的一個成員，其特征在于： a) 所述病毒是魚的鱗片脫落疾病的病原體，且 b) MCP基因的核苷酸序列與在SEQIDNO: 1中描繪的核苷酸序列具有至少80%的同 一,性水平。
[0041] 就本發明的目的而言，同一性水平應理解為SEQIDNO: 1的序列與必須要確定其 同一性水平的病毒的主要衣殼蛋白的對應區域的同一性水平。
[0042] 用于確定同一性水平的合適程序是NCBI'sBasicLocalAlignmentSearchTool 的核苷酸blast程序（blastn)，其使用"比對2個或更多個序列"選項和標準設置（http:// blast,ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 〇
[0043] 就本發明的目的而言，分離是指：脫離所述病毒在自然界中伴隨的組織。分離的病 毒的一個例子是存在于細胞培養物中的病毒。
[0044] 該實施方案的一種優選形式涉及具有主要衣殼蛋白（MCP)基因的病毒，所述主要 衣殼蛋白（MCP)基因與SEQIDNO: 1所示的MCP的核苷酸序列具有至少82%的同一性水 平，更優選 84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或甚至 100%，以該 優先次序。
[0045] 表征根據本發明的病毒的另一種可選方式涉及所述病毒的ATP酶的序列。
[0046]SEQIDN0: 3顯示了根據本發明的病毒的ATP酶基因的核苷酸序列的一個通常例 子。但是，如上面所解釋的，發現了導致ATP酶序列的微小變化的天然變異。
[0047] 因而，本發明的該實施方案的另一種形式涉及一種分離的病毒，其是包含MCP基 因和