組入有水凝膠的層疊細胞膜片的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及組入有水凝膠、優選組入有明膠水凝膠，或更優選組入有明膠水凝膠粒子的層疊細胞膜片及其制作方法。
【背景技術】
[0002]近年來，作為對因疾病或受傷所致的細胞內組織缺損補充細胞的醫療方法，正在研究使用細胞膜片的細胞移植療法。特別是，正在研究心肌細胞置換療法，因為成人的心肌細胞很少增殖，從而由缺血性的心疾病等導致的心肌細胞的缺失成為不可挽回的損傷。
[0003]從而，提出了使用由心肌細胞制作的心肌細胞膜片。為了使這樣的再生療法成功，心血管細胞片段的充分定植是必不可少的。進而，正在研究作為用于上述目的的心肌細胞，使用由胚胎干細胞(ESC)或誘導多能干細胞(iPSC)衍生的心臟細胞分段(NPL 1、2和PTLI)的方法。
[0004]確認了通過移植由這些細胞制作的3層的心臟組織膜片，可抑制大鼠的心肌梗塞后的心臟功能降低。然而，該降低并非由誘導心肌細胞的直接影響導致，而是由因間接性旁分泌效應(包含利用細胞所釋放的細胞因子的血管再生)而產生的左心室重構的抑制而導致(NPL 3)ο
[0005]因此，為了將心肌細胞膜片定植在心肌層上，則必須給與更多的心肌細胞，從而始終期望含有大量心肌細胞的更厚的膜片。然而，確認到移植沒有血管的4層以上的心肌細胞膜片時，在氧和養分的供給范圍外的細胞無法生存，因此定植的細胞數不會改變。從而，認為需要進一步的技術開發以制作在細胞置換療法中有效的心肌細胞膜片。
[0006]明膠水凝膠是可生物降解的生物材料，可以用作細胞培養基質或支架，并且報告有通過在培養細胞凝集體中的含有該凝膠的粒子，可改善例如氧供給等，并從而改善細胞的狀態(NPL 4和PTL 2) ο
[0007]使用明膠水凝膠來制作移植用細胞膜片的公知的方法包含對膜片貼附明膠水凝膠以使細胞膜片容易從細胞培養基質脫離的方法(PTL 3、4和5)。
[0008]引用文獻目錄
[0009]專利文獻
[0010]PTL 1:國際公開 2009/118928 號
[0011]PTL 2:國際公開 2011/059112 號
[0012]PTL 3:日本未經審查的專利申請公開2011-224398號
[0013]PTL 4:日本未經審查的專利申請公開2013-198437號
[0014]PTL 5:日本未經審查的專利申請公開2014-75979號
[0015]非專利文獻
[0016]NPL 1: Yamashita J 等人，Nature，408:92-6，2000
[0017]NPL 2: Yamashita JK 等人，FASEB J.，19:1534-6，2005
[0018]NPL 3:Masumoto H 等人，Stem Cells，30:1196-205，2012
[0019]NPL 4:Hayashi K，Tabata Y.，Acta B1mater，7:2797-803，2011
【發明內容】
[0020]技術問題
[0021]本發明的目的涉及組入有水凝膠、優選組入有水凝膠粒子、或更優選組入有明膠水凝膠粒子的層疊細胞膜片，或包含該膜片的醫藥組合物，以及使用水凝膠、優選使用水凝膠粒子、或更優選使用明膠水凝膠粒子來層疊細胞膜片的方法。
[0022]本發明的目標是通過層疊細胞膜片來防止細胞膜片中的活細胞數減少以及隨之產生的細胞功能的降低。
[0023]本發明人等發現，通過使用特定類型的水凝膠材料將細胞膜片層疊，細胞膜片中的活細胞數明顯地增加，以致實現上述目標，所述水凝膠材料優選為明膠水凝膠、更優選為明膠水凝膠粒子。此外，確認到通過該方法，細胞可在5層以上的層疊膜片中生存，并且該膜片的功能得到改善。
[0024]基于如上所述的結果，本發明人等通過使用明膠水凝膠粒子成功地層疊了細胞膜片，并完成了本發明。
[0025]從而，本發明包含下述特征:
[0026][I] 一種方法，是層疊細胞膜片的方法，包含使用水凝膠來層疊細胞膜片；
[0027][2]根據[I]所述的方法，其中，由能夠使細胞生存所需要的物質擴散的材料制成所述水凝膠或所述水凝膠為能夠使細胞生存所需要的物質擴散的形式；
[0028][3]根據[I]或[2]所述的方法，其中，所述水凝膠為明膠水凝膠；
[0029][4]根據[I]?[3]中任一項所述的方法，其中，所述水凝膠為水凝膠粒子；
[0030][5]根據[4]所述的方法，其中，所述水凝膠的凝膠粒子為明膠水凝膠粒子；
[0031][6]根據[5]所述的方法，其中，所述明膠水凝膠的凝膠粒子是在明膠分子之間具有分子間交聯的明膠水凝膠粒子；
[0032][7]根據[5]或[6]所述的方法，其中，所述明膠水凝膠粒子由在干燥狀態的粒子尺寸為20 μ m?32 μ m的粒子組成；
[0033][8]根據[I]?[7]任一項所述的方法，包含:在第一細胞膜片或第一層疊細胞膜片、與第二細胞膜片或第二層疊細胞膜片之間，添加水凝膠、優選添加水凝膠粒子、或更優選添加明膠水凝膠粒子；
[0034][9]根據[8]所述的方法，其中，所述層疊細胞膜片由2?3張細胞膜片構成；
[0035][10]根據[8]或[9]所述的方法，其包含:以相對于細胞膜片的單位面積為500 μ g/cm2?2000 μ g/cm2的量添加水凝膠、優選添加水凝膠粒子、或更優選添加明膠水凝膠粒子；
[0036][11] 一種層疊細胞膜片，通過[I]?[10]中任一項所述的方法來進行層疊；
[0037][12]根據[11]所述的層疊細胞膜片，其包含層疊的4張以上的細胞膜片；
[0038][13] 一種醫藥組合物，其包含[11]或[12]所述的層疊細胞膜片；
[0039][14]根據[I]?[10]中任一項所述的方法，其中，所述細胞膜片為心肌細胞膜片;
[0040][15]根據[I]?[10]中任一項所述的方法，其中，所述細胞膜片為包含心肌細胞、內皮細胞和壁細胞的心臟細胞膜片；
[0041][16]根據[14]或[15]所述的方法，其中，由多能干細胞制作所述心肌細胞；
[0042][17]根據[15]或[16]所述的方法，其中，由多能干細胞制作所述內皮細胞；
[0043][18]根據[15]?[17]中任一項所述的方法，其中，由多能干細胞制作所述壁細胞；
[0044][19]根據[14]to[18]中任一項所述的方法，其中，所述多能干細胞為誘導多能干細胞(iPS細胞);
[0045][20]層疊細胞膜片，通過[14]?[19]中任一項所述的方法層疊；
[0046][21]根據[20]所述的層疊細胞膜片，其包含層疊的4張以上的細胞膜片；
[0047][22] 一種心臟疾病用治療劑，包含[11]、[12]、[20]和[21]中任一項所述的層疊細胞膜片。
[0048]發明的有利效果
[0049]根據本發明的方法，能夠在細胞生存的狀態下層疊細胞膜片。進而，生成的細胞膜片能夠應用于細胞置換療法。
【附圖說明】
[0050]圖1表示用于形成心臟細胞膜片的規程。圖中，EC代表內皮細胞、VEGF代表血管內皮生長因子、cAMP代表環磷酸腺苷、MC代表壁細胞、CM代表心肌細胞、CsA代表環孢霉素A、以及M.C.代表培養基更換。
[0051]圖2表示根據本發明的方法通過使用明膠水凝膠微粒子進行細胞膜片層疊的步驟。a面表示將膜片放平并靜置在經明膠涂覆的培養皿上的步驟出面表示吸出培養基并固定培養皿和膜片的步驟；(:面表示對細胞膜片滴加明膠水凝膠微粒子的步驟。d面表示在37°C下孵育30分鐘的步驟。e面表示明膠水凝膠處理后，層疊另一張細胞膜片的步驟。f面表示反復層疊5層后的細胞膜片。
[0052]圖3表示根據本發明層疊膜片(5層)的組織標本的照片和將其量化的結果。A面表示來自下述對象群的蘇木精-伊紅(HE)染色圖像:在未使用明膠水凝膠而層疊的對象群(對照)、向各層添加250 μ g的明膠水凝膠微粒子(在干燥狀態的粒子尺寸為20?32 μm)的群(低劑量)、以及滴加750 μ g的明膠水凝膠微粒子(在干燥狀態的粒子尺寸20?32μπι)的群(高劑量群)。圖中，黑色箭頭指明膠水凝膠微粒子。B面中，左側圖表表示細胞膜片的厚度的各群之間的比較，而右側圖表表示HE染色呈陽性的細胞區面積的各群之間的比較。
[0053]圖4表示根據本發明層疊膜片(5層)的組織標本的照片和將其量化的結果。A面表示來自下述對象群的蘇木精-伊紅(HE)染色圖像:在未使用明膠水凝膠的狀態下層疊的對象群(對照)、滴加干燥狀態的粒子尺寸為小于20 μπι的粒子的群、滴加干燥狀態的粒子尺寸為20?32 μπι的粒子的群、以及滴加干燥狀態的粒子尺寸為32?53 μπι的粒子的群。B面中，左側圖表表示各群之間細胞膜片的厚度的比較，而右側圖表表示各群之間HE染色呈陽性的細胞區面積的比較。
[0054]圖5的圖表表示將本發明的層疊膜片(5層)移植在通過公知方法從無胸腺裸大鼠(雄性，10?12周大)生成的心肌梗塞模型大鼠的心臟前壁時的左心室(LV)縮短率(% )的經時變化。圖中，⑴示出假手術未處理群、⑵示出未使用明膠水凝膠的層疊膜片(5層)、以及(3)示出本發明的層疊膜片(5層)。
【具體實施方式】
[0055]1.水凝膠
[0056]這里使用的“水凝膠”是指能夠含有大量水的物質，由能夠容易地使細胞生存所需要的物質擴散的材料或形態如氧、水、水溶性養分以及多肽如酶類和細胞因子類，代謝物等制成，并且通常是生物相容性的。水凝膠的形狀和形態，只要能夠組入細胞膜片中就沒有特別限制，可使用各種形狀和形態，例如粒子狀、顆粒狀、薄膜、管狀、圓盤狀、網狀、網眼狀、多孔狀、懸浮狀或分散狀。特別是，優選作為含有膠體粒子的水溶液凝固的結果而形成的水凝膠粒子。只要具有上述水凝膠性質，就可以使用由任何材料制成的粒子。例子包含例如由交聯下述成分而得的水凝膠制成的粒子，所述成分為:水溶性、親水性或吸水性的合成聚合物如聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚乙烯醇、聚乳酸和聚乙二醇酸，多聚糖，蛋白質以及核酸。多聚糖的例子包含但不限于糖胺聚糖如透明質酸和硫酸軟骨素、淀粉、糖原、瓊脂糖、果膠、纖維素等。蛋白質的例子包含但不限于膠原蛋白和其水解明膠、蛋白聚糖、纖維連接蛋白、玻璃粘連蛋白、層粘連蛋白、巢蛋白(entactin)、腱生蛋白、凝血酶敏感蛋白、血管性血友病因子、骨橋蛋白、纖維蛋白原等。適合本發明的粒子優選具有生物相容性且由在人體中由細胞降解的材料制成，更優選為由明膠制成的粒子。因此，本發明中，優選的水凝膠凝膠粒子為明膠水凝膠粒子。
[0057]本發明中，水凝膠或水凝膠粒子通過在上述水凝膠、優選為水凝膠粒子、更優選為明膠水凝膠粒子等的表面上涂覆細胞粘接蛋白質如膠原蛋白、纖維連接蛋白、玻璃粘連蛋白、層粘連蛋白、糖胺聚糖等和其活性肽，或生物功能糖，低聚糖，多聚糖等而得，或者通過將這樣的物質固定在表面上而得，可用于改善培養條件和細胞增殖。
[0058]本發明中所使用的明膠水凝膠粒子為微粒狀的明膠水凝膠，其通過對明膠分子進行化學反應、熱脫水工藝、輻射、紫外線輻射或電子束照射，進行交聯而得。作為化學交聯劑，可使用水溶性碳二亞胺如EDC、環氧丙燒、二環氧化合物(diepoxy compound)以及在輕基、羧基、氨基、硫基、咪唑基等中的兩個之間形成化學鍵的縮合劑等。
[0059]本發明中的明膠是指改性的膠原蛋白，其中，膠原蛋白的肽鏈之間的鹽鍵和氫鍵通過酸或堿或酶處理等而產生斷裂，以致膠原蛋白不可逆地變成水溶性蛋白質。膠原蛋白可以從動物或植物收集，或可以使用重組膠原蛋白。本發明中所使用的明膠可以是酸性明膠和堿性明膠中的任