甘蔗線條花葉病毒rt-lamp引物組、檢測方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于甘蔗線條花葉病毒檢測技術領域，尤其涉及一種甘蔗線條花葉病毒 RT-LAMP引物組、檢測方法及其應用。
【背景技術】
[0002] 甘鹿線條花葉病毒（Sugarcanestreakmosaicvirus，SCSMV)屬于馬鈴薯Y病毒 科（Potyviridae)禾本科病毒屬（Poacevirus)，是引起甘鹿產生花葉癥狀的一種新病原。 目前世界上僅在印度、斯里蘭卡、泰國、越南和印度尼西亞、法國以及中國有報道。在我國， 對SCSMV的研究相對較少。2010年，許東林等在我國引自巴基斯坦的甘蔗種質中檢測到該 病毒并對其全序列進行了測定分析，是國內有關該病毒的首次報道。賀振等自2009年起對 云南省甘鹿花葉病病原進行采樣鑒定，鑒定結果發現SCSMV已成為云南省甘鹿產區引起甘 蔗花葉病的主要病原之一，部分地區陽性檢出率高達59%。秦碧霞等對廣西甘蔗花葉病病 原鑒定后發現，SCSMV在廣西也有發生。
[0003] 目前，針對甘蔗線條花葉病毒的檢測主要有電鏡觀察法、分子生物學方法、血清學 方法，這些方法通常需要配備昂貴的儀器（PCR儀、電鏡等），且較為費時。
[0004]環介導等溫擴增技術（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是一種 先進的恒溫核酸擴增方法，其特點是針對靶基因的6個區域設計4條特異引物，利用一種鏈 置換DNA聚合酶（BstDNApolymerase)在等溫（65°C左右）條件下保溫幾十分鐘，即可完 成核酸擴增反應，通過熒光染色的方法在數分鐘內即可觀察結果。該方法不需要模板的熱 變性、長時間溫度循環、繁瑣的電泳、紫外觀察等過程。
[0005]LAMP作為一種嶄新的DNA擴增技術，具有簡便、快速、特異性強等優點，已廣泛應 用于人類或動植物的各種病毒、細菌等引起的疾病或病害的快速檢測和快速診斷。
[0006] 公開于該【背景技術】部分的信息僅僅旨在增加對本發明的總體背景的理解，而不應 當被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已為本領域一般技術人員所公知的現有技術。
【發明內容】
[0007] 本發明要解決的技術問題是提供一種簡便、快速、特異性強的甘蔗線條花葉病毒 RT-LAMP引物組、檢測方法及其應用。
[0008] 為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：
[0009] 甘蔗線條花葉病毒RT-LAMP檢測引物組，包括外側引物對F3和B3、內側引物對 FIP和BIP，其分別具有SEQIDNo. 1至SEQIDNo. 4所示的序列。
[0010] 本發明還提供一種甘蔗線條花葉病毒RT-LAMP檢測方法，是利用RT-LAMP檢測引 物組，在63°C恒溫反應條件下，進行環介導恒溫擴增反應60min，擴增完成后80°C再反應 5min，然后利用瓊脂糖凝膠電泳或熒光染色，鑒定植株樣品是否感染甘蔗線條花葉病毒；所 述的RT-LAMP檢測引物組包括外側引物對F3和B3、內側引物對FIP和BIP，其分別具有SEQ IDNo. 1至SEQIDNo. 4所示的序列。
[0011] 作為優選，所述的外側引物對、內側引物對的濃度比為1:4。
[0012] 作為優選，所述的外側引物對、內側引物對的濃度分別為0. 2μΜ和0. 8μΜ。
[0013] 此外，本發明還提供一種甘蔗線條花葉病毒RT-LAMP檢測試劑盒，包括Α試液、Β試 液和C試液。
[0014]作為優選，所述的A試液為LAMP反應體系，其中含有RT-LAMPbuffer、MMLV-Bst 混合液、RNaseInhibitor、RNase-FreeWater和RT-LAMP檢測引物組。
[0015] 作為優選，所述的A試液中含RT-LAMPbuffer4μL、MMLV-Bst混合液1. 5μL、 RNase-FreeWater11.5μL、RNaseInhibitor1μL、RT-LAMP檢測引物組 5μL，其中F3 和 B3引物各0. 5μL，終濃度均為0. 2μM;FIP和BIP引物各2μL，終濃度均為0. 8μΜ;所述的 引物F3、Β3、FIP和ΒΙΡ分別具有SEQIDNo. 1至SEQIDNo. 4所示的序列。
[0016] 作為優選，所述的B試液含甘蔗線條花葉病毒RNA ;所述的C試液為RNase free Water〇
[0017] 作為優選，所述的B試液作為陽性對照；所述的C試液作為陰性對照。
[0018] 所述的甘蔗線條花葉病毒RT-LAMP引物組、檢測方法或試劑盒在感病甘蔗及其它 作物上檢測甘蔗線條花葉病毒的應用。
[0019] 與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
[0020] 1.本發明獨創性地采用環介導等溫擴增（LAMP)技術，并根據甘蔗線條花葉病毒 CP基因序列設計了相應的RT-LAMP檢測引物組，包括外側引物對F3和B3、內側引物對FIP 和BIP，并由此發明了用于檢測甘蔗線條花葉病毒的RT-LAMP檢測方法及試劑盒。
[0021] 2.使用本發明的甘蔗線條花葉病毒的RT-LAMP檢測方法及試劑盒，僅需通過對甘 蔗等疑似感病植株樣品進行RNA提取并進行環介導等溫擴增，即可快速檢測出是否感染甘 蔗線條花葉病毒，方便基層快速、準確、簡便地進行病害診治，進而采取適當的防治措施，減 少病害帶來的損失。
【附圖說明】
[0022] 圖1為不同反應溫度條件下RT-LAMP擴增結果的電泳圖；
[0023]其中：M-DL2000 標準分子量；1-陰性對照；2-60°C;3-61°C;4-62°C; 5-63°C; 6- 64°C; 7-65 °C。
[0024] 圖2為RT-LAMP靈敏性實驗電泳圖；
[0025]其中：M-DL2000 標準分子量；1-陰性對照；2-167. 9ng/μL;3-167· 9X10Sg/ yL；4-167.9X10 2ng/yL；5-167.9X10 3ng/yL；6-167.9X10 4ng/yL； 7- 167. 9X10 5ng/yL；8-167. 9X10 6ng/μL；9-167. 9X10 7ng/μL；l〇-167. 9X10 8ng/ μL〇
[0026] 圖3為RT-PCR靈敏性實驗電泳圖；
[0027]其中：M-DL2000 標準分子量；1-陰性對照；2-167. 9ng/μL;3-167· 9X10Sg/ yL；4-167.9X10 2ng/yL；5-167.9X10 3ng/yL；6-167.9X10 4ng/yL； 7-167. 9X10 5ng/yL；8-167. 9X10 6ng/μL；9-167. 9X10 7ng/μL；l〇-167. 9X10 8ng/ μL〇
[0028]圖4為RT-LAMP檢測甘蔗樣品電泳圖；
[0029] 其中：M-DL2000標準分子量；1-陰性對照；2-陽性對照；3-7為采集的甘蔗樣品。
[0030] 圖5為SYBGreen熒光染料檢測RT-LAMP擴增產物結果圖；
[0031] 其中：1_陰性對照；2-陽性對照；3-7為采集的甘蔗樣品。
【具體實施方式】
[0032] 下面結合具體實施例，對本發明作進一步詳細的闡述，但本發明的實施方式并不 局限于實施例表示的范圍。這些實施例僅用于說明本發明，而非用于限制本發明的范圍。此 外，在閱讀本發明的內容后，本領域的技術人員可以對本發明作各種修改，這些等價變化同 樣落于本發明所附權利要求書所限定的范圍。
[0033] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所 使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0034]實施例1:甘蔗線條花葉病毒RT-LAMP引物設計
[0035]根據NCBI上已報道的甘蔗線條花葉病毒CP基因序列（JX467699,JN163911)，結 合對甘蔗線條花葉病毒的測序結果，利用VECTORNTIalignX進行比對分析，選取基因序列 保守區域9125-9315nt，利用在線引物設計軟件PrimerExplorerV4設計引物，最后選取以 下RT-LAMP檢測引物組：
[0036] 外側引物對F3和B3:
[0037]上游引物F3:AAGTGGACGAAAGCTGTGTT(見序列表SEQIDNo.1);
[0038]下游引物B3 :TTCCCGCTACGAACCGAG(見序列表SEQIDNo.2)。
[0039] 內側引物對FIP和BIP:
[0040] 上游引物FIP:
[0041] GGCCCCATTTCGAACTCCACTTGGATGGAGCTGATGGGACA(見序列表SEQIDNo.3);
[0042] 下游引物BIP:
[0043]AACGCCAAACCTGGTATTCGCGCTGAACCCACTTGTACGCC(見序列表SEQIDNo.4)。
[0044]實施例2 :甘蔗線條花葉病毒RT-LAMP反應體系的建立
[0045] 通過設置不同終濃度的外側（F3/B3)、內側（FIP/BIP)引物配比，確定組合為 0. 2uM: 0. 8uM，溫