一種α-L-巖藻糖苷酶檢測試劑盒及制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種人體血清中a-L-巖藻糖苷酶檢測試劑及其制備方法，屬于血清 樣本中α-L-巖藻糖苷酶含量檢測的技術領域。
【背景技術】
[0002] a-L-巖藻糖苷酶（a-L-Fucosidase，AFU)是一種溶酶體酸性水解酶，廣泛分布 于人體內的各種組織、細胞及體液中。1977年Bauer等在動物實驗中觀察到Morris鼠肝癌 組織中AFU活力較正常肝臟高7倍，且與腫瘤生長期有關。1980年法國學者Dcugnier等首 先在3例原發性肝癌血清中發現AFU活性升高，并提出把AFU作為診斷肝癌的一種新的標 志酶，并被后來的眾多研究所證實。近年來，AFU檢測的方法學研究及其他腫瘤或非腫瘤性 疾病的血清AFU水平變化的研究也日益增多。
[0003] 隨著AFU研究的日益增多，AFU檢測方法學和產品也在不斷的豐富和完善，目前 AFU的測定方法學主要有熒光法、比色法和速率法，各種檢測方法各有優勢。其中，熒光法 是利用AFU水解4-甲基傘型酮a-L-巖藻吡喃糖苷釋放4-甲基傘型酮，用堿性緩沖液終 止反應，并使產物呈現熒光，用360nm或365nm激發波長和400nm或448nm發射波長檢測熒 光強度，對照不同濃度4-甲基傘型酮制備的標準曲線求酶的活性。此法敏感性高，適用范 圍廣，但是該檢測方法對配套的儀器要求很高，不適合用于自動化檢測。其中，終點比色法 也是近幾年新興的檢測方法，他是以對硝基苯酸α_L_巖澡糖苷為底物，在AFU催化下生成 a-L-巖藻糖苷和對硝基苯酚，對硝基苯酚在堿性溶液中呈黃色。用分光光度計在405nm波 長下比色，即可得出AFU的含量，本檢測方法反應時間較長，且操作繁瑣，干擾因素較多，因 此也不適用于自動化檢測。速率法是最近應用最普遍的檢測方法，他是利用血清樣本中AFU 催化2-氯-對硝基酚a-L-巖藻吡喃糖苷（CNP-F)水解生成2-氯-對硝基酚（CNP)，在 405nm或410nm波長下監測CNP生成速率，計算出AFU活性。該檢測方法操作簡便，測定時 間短，且靈敏度和抗干擾性能都很好，采用該方法學制備出來的檢測試劑盒適用于各種類 型的生化分析儀。
[0004] 隨著AFU檢測方法學的不斷改進和完善，目前已經出現一些適用于AFU檢測的診 斷試劑盒出現，但是這些檢測試劑盒會存在一些檢測方面的問題，比如抗干擾性能、特異 性、準確性等方面的問題，因此亟待開發一種AFU檢測試劑盒，能滿足檢驗醫學的各項需 求。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的之一是為了克服以上的技術缺陷提供一種性能優良的a-L-巖藻 糖苷酶檢測試劑盒。
[0006] 本發明的目的之二是為了提供一種性能優良的a-L-巖藻糖苷酶檢測試劑盒的 制備方法。
[0007] 為實現上述目的，本發明可采取下述技術方案：
[0008] -種a-L-巖藻糖苷酶含量檢測試劑盒，由獨立的試劑1和試劑2組成，其中試劑 1的組分包括緩沖劑、防腐劑、金屬離子螯合劑、穩定劑和水；試劑2的組分包括緩沖劑、防 腐劑、酶作用底物、表面活性劑、穩定劑和水。
[0009] 進一步地，所述的緩沖劑為：三羥甲基甲胺基乙磺酸、2-(N-嗎啡啉）乙磺酸、 N-(2-羥乙基）哌嗪-Ν' -2-乙烷磺酸、三羥甲基甲胺基丙磺酸或哌嗪-1，4-二羥基丙磺酸。
[0010] 進一步地，所述的防腐劑為咪唑烷基脲。
[0011] 進一步地，所述的穩定劑為氯化鈉。
[0012] 進一步地，所述的金屬離子螯合劑為乙二胺四乙酸二鈉，氨基三乙酸或二亞乙基 三胺五乙酸及其鹽。
[0013] 進一步地，所述的酶作用的底物為MG-2-氯-對硝基苯酚-a-L-巖藻糖苷。
[0014] 進一步地，所述的表面活性劑為曲拉通Χ-100或乙基苯基聚乙二醇。
[0015] 進一步地，每1升試劑1中各組分的含量為：緩沖劑2_80g，防腐劑0.l-10g，金屬 離子螯合劑〇. 5-10g，穩定劑0.l-8g;每1升試劑2中各組分的含量優選為：緩沖劑2-80g， 防腐劑〇.l-l〇g，酶作用底物〇. 5-10g，表面活性劑0.l-5ml，穩定劑0.l-8g;
[0016] 進一步地，每1升試劑1中各組分的含量為：緩沖劑5_40g，防腐劑0. 75_5g，金屬 離子螯合劑〇. 8-4g，穩定劑l-5g;每1升試劑2中各組分的含量為：緩沖劑5-40g，防腐劑 0. 75-5g，酶作用底物2-5g，表面活性劑l-3ml，穩定劑l-5g。
[0017] 上述的試劑盒的制備方法，（1)制備試劑1 :將各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中， 混合均勾，用lmol/L的鹽酸或氫氧化鈉溶液調節pH至6. 5-8. 5之間，然后用蒸餾水或雙蒸 水定容至1L; (2)制備試劑2 :將各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，混合均勻，用lmol/L的 鹽酸或氫氧化鈉溶液調節pH至6. 5-8. 5之間，然后用蒸餾水或雙蒸水定容至1L; (3)將試 劑1和試劑2單獨分裝，密封，即得。
[0018] 本發明提供的一種a-L-巖藻糖苷酶檢測試劑盒，采用液體雙試劑模式，有效地 避免了非特異性反應的干擾，同時可以最大限度減少來自樣本本身濁度的干擾，保證了測 定結果的穩定可靠，具有穩定性好，精確度高，線性測試范圍寬，重復性好，抗干擾性強等優 點。
【附圖說明】
[0019] 圖1是本發明實施例1提供的試劑盒與購自德國AutecDiagnostica公司的檢測 試劑盒的檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0020] 本發明的檢測試劑盒以MG-2-氯-對硝基苯酚-a-L-巖藻糖苷（MG-CNPF)為底 物，利用MG-CNPF在反應體系中的靈敏度、精密度、抗干擾及有利于試劑穩定的特點，一定 程度的提高檢測試劑盒的性能，同時通過與其他試劑組分的配比組合，進一步的優化和提 升試劑的性能。本發明的檢測試劑盒有兩種組分，分別為試劑1和試劑2,這種液體雙試 劑組合，有利于樣本的充分稀釋溶解、稀釋，同時也能有利于樣本中的AFU與底物MG-CNPF 充分接觸并發生良好的反應，并能一定程度的避免血液樣本中的各項雜質對檢測結果的干 擾，具體的試劑盒的組分及配比如下：
[0021] -種a-L-巖藻糖苷酶含量檢測試劑盒，該檢測試劑盒由獨立的試劑1和試劑2 組成，其中試劑1的組分包括緩沖劑、防腐劑、金屬離子螯合劑、穩定劑和水；試劑2的組分 包括緩沖劑、防腐劑、酶作用底物（MG-CNPF)、表面活性劑、穩定劑和水。
[0022] 為了達到更好的檢測效果，本發明檢測試劑盒中，每1升試劑1中各組分的含量優 選為：緩沖劑2-80g，防腐劑0.l-10g，金屬離子螯合劑0. 5-10g，穩定劑0.l-8g;
[0023] 進一步優選的，每1升試劑1中各組分的含量優選為：緩沖劑5_40g，防腐劑 0· 75-5g，金屬離子螯合劑0· 8-4g，穩定劑l-5g;
[0024] 最優選的，每1升試劑1中各組分的含量為：緩沖劑23g，防腐劑2. 6g，金屬離子螯 合劑2g，穩定劑2g。
[0025] 每1升試劑2中各組分的含量優選為：緩沖劑2_80g，防腐劑0.l-10g，酶作用底物 0· 5-10g，表面活性劑0·l-5ml，穩定劑0·l-8g;
[0026] 進一步優選的，每1升試劑2中各組分的含量優選為：緩沖劑5_40g，防腐劑 0. 75-5g，酶作用底物2-5g，表面活性劑l-3ml，穩定劑l-5g;
[0027] 最優選的，每1升試劑2中各組分的含量優選為：緩沖劑23g，防腐劑2. 6g，酶作用 底物3g，表面活性劑2ml，穩定劑2g;
[0028] 本發明檢測試劑盒中試劑1或試劑2所述的緩沖劑是能夠維持反應體系在 一定酸堿度范圍的物質，例如：三羥甲基甲胺基乙磺酸（TES)、2-(N_嗎啡啉）乙磺酸 (MES)、N-(2-羥乙基）哌嗪-Ν' -2-乙烷磺酸（HEPES)、三羥甲基甲胺基丙磺酸（TAPS)、 哌嗪-1，4-二羥基丙磺酸（P0PS0)等，為了達到更好的檢測效果，本發明所用的緩沖劑為 2- (N-嗎啡啉）乙磺酸，該緩沖液的優點在于它不參加和不干擾生物化學反應過程，對酶催 化反應等無抑制作用，是用于酶功能研究很好的緩沖劑。
[0029] 本發明檢測試劑盒中試劑1和試劑2所述的防腐劑主要是為了防止細菌滋生導致 的產品變質，所以任何一種能起到防止細菌滋生作用的防腐劑均能適用于本發明，優選的， 本發明試劑1和試劑2中所述的防腐劑為咪唑烷基脲。
[0030] 本發明檢測試劑盒中試劑1和試劑2所述的穩定劑主要是為了維持反應體系的穩 定性，本發明通過研究發現在反應試劑中加入一定量的氯化鈉有助于維持反應體系的穩定 性，因此，本發明的試劑1和試劑2優選氯化鈉作為本發明的穩定劑。
[0031] 本發明檢測試劑盒中試劑1中所述的金屬離子螯合劑能夠絡合檢測樣本中的二 價金屬離子，以減少二價金屬離子造成的干擾；因此能夠絡合二價金屬離子的各種金屬離 子絡合物均能夠適用于作為試劑I中所述的金屬離子絡合物，例如：乙二胺四乙酸二鈉，氨 基三乙酸、二亞乙基三胺五乙酸及其鹽等，本發明優選乙二胺四乙酸二鈉（EDTA)作為試劑 I中所述的金屬離子絡合物。
[0032] 本發明檢測試劑盒中試劑2中所述的酶作用的底物為MG-2-氯-對硝基苯 酚-a-L-巖藻糖苷，本發明采用MG-2-氯-對硝基苯酚-a-L-巖藻糖苷（CNPF)作為酶作 用的底物，由于AFU催化CNPF釋放2-氯-4-硝基苯酚（CNP)，后者呈色的ΡΗ范圍頗寬，在 AFU最適應的ΡΗ條件下，仍可呈現明顯黃色，引起405nm~410nm處吸光度升高；連續監測 吸光度的升高速率，可計算出樣品中AFU活性。此外，采用該作用底物在反應的特異性和靈 敏度方面更有優勢，有利于提高試劑檢測的準確性和精密度。
[0033] 本發明檢測試劑盒中試劑2中所述的表面活性劑主要起到促進檢測樣本中各物 質的溶解，達到減少樣本濁度對測定結果的影響的目的；因此，現有的具有增溶性質的表面 活性劑都可作為試劑I或試劑II中所述的表面活性劑，例如，曲拉通X-100、乙基苯基聚乙 二醇等，本發明檢測試劑盒中優選曲拉通X-100作為表面活性劑。
[0034] 本發明檢測試劑盒中所用到的每種組分均能通過商業途徑從生物試劑公司或醫 藥公司購買得到。
[0035] 本發明的另外一個目的是提供一種制備α -L-巖藻糖苷酶檢測試劑盒的方法，包 括：
[0036] (1)制備試劑1 :將各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，混合均勻，用lmol/L的鹽酸 或氫氧化鈉溶液調節pH至6. 5-8. 5之間，然后用蒸餾水或雙蒸水定容至1L; (2)制備試劑 2 :將各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，混合均勻，用lmol/L的鹽酸或氫氧化鈉溶液調節pH 至6. 5-8. 5之間，然后用蒸餾水或雙蒸水定容至1L; (3)將試劑I和試劑II單獨分裝，密封， 即得。
[0037] 采用本發明制備的檢測試劑盒其基本的實驗參數如下：
[0038]
[0039] 本發明檢測試劑盒在生化儀上的基本操作流程如下所述：
[0040]
[0042] 混勻后，37°C恒溫90秒后測定初始吸光度，然后再180秒內準確測定平均每分鐘 吸光度變化率AA/min。
[0043] 本發明檢測試劑盒在檢測過程