一種體外獲得造血干/祖細胞的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種體外高效獲得人多能干細胞來源的造血 干/祖細胞的方法。
【背景技術】
[0002] 造血干細胞：（hematopoieticstemcell，HSC)是骨髓中的多能干細胞，能夠分裂 形成兩種類型的細胞：一種仍然作為干細胞，但另一種成為祖細胞（progenitorcell)，即 次一級的干細胞，又稱為爆發集落形成單位（burstformingunits，BFUs)和集落形成單位 (colony-formingunits，CFUs)，它們可分裂形成多種類型的細胞群，包括：粒性白細胞、單 核細胞、血小板、紅細胞、T細胞與B細胞等。造血干細胞是指尚未發育成熟的細胞，是所有 造血細胞和免疫細胞的起源。
[0003] 體內畸胎瘤生血模式雖然能獲得造血干細胞，但該分化體系技術復雜，變量太多， 獲得的造血干/祖細胞效率低下，而且體內畸胎瘤模型分離造血干/祖細胞困難，耗時（僅 僅畸胎瘤形成就得耗時2個月以上），容易引入異種病原污染。體內分化畸胎瘤法獲得血液 細胞存在效率低下、過程繁瑣等問題。
[0004] 目前體外誘導人多能干細胞定向分化為血液細胞的方法主要有以下幾種：1)EB 法；2)多能干細胞與基質細胞共培養法；3) 2D單層誘導法。體內分化方法主要是畸胎瘤法。
[0005] 通過EB法獲得血液細胞效率低下、無法獲得真正的HSC;通過基質細胞共培養獲 得血液細胞效率低，不可控的因素眾多造成的效率不穩定，也無法獲得真正的HSC;2D單 層誘導法可以通過優化體系在無血清、無飼養層及成分確定的誘導分化培養基的條件下開 展，需要解決的問題仍然是提高分化效率和獲得真正的HSC。
[0006] 綜上，目前體外誘導人多能干細胞定向分化為造血細胞存在定向分化效率低下、 獲得的造血干/祖細胞多潛能性差等瓶頸，具體表現為人多能干細胞向血液細胞分化的效 率低，飼養細胞及血清等成分容易引入病原污染，無法滿足臨床移植GMP級別要求，亟需發 展出新的體外誘導人多能干細胞定向分化為血液細胞的方法。
【發明內容】
[0007] 本發明針對上述問題，通過篩選小分子化合物及優化無血清、無飼養細胞的途徑 提高了多能干細胞向造血分化的效率，并且所獲人的造血干/祖細胞的百分率和得率明顯 提高，體外集落形成實驗表明成功獲得分化來源的多潛能造血干/祖細胞，為臨床多能干 細胞分化來源的造血干/祖細胞應用奠定了基礎。
[0008] 發明人利用人多能干細胞2D單層誘導法發現，嘧啶吲哚衍生物UM171可以提高人 多能干細胞向血液細胞分化的效率，CFU實驗證明獲得的血液細胞含有包括造血干細胞在 內的多潛能造血干/祖細胞。
[0009] UM171((lr,4r)-Nl-(2-benzyl-7-(2-methyl-2H-tetrazol-5-yl)-9H-pyrimi do [4, 5_b] indol-4-yl) cyclohexane-1，4-diamine，其結構式如下：
[0010]
[0011] 本發明提供的體外一種體外獲得人造血干/祖細胞的方法，包含以下步驟：步 驟1 :將無飼養層培養傳代40-70代的人多能干細胞用EDTA消化法制備hES克隆，種植到 matrigel包被過的細胞培養板上，補加mTeSR培養24小時；
[0012] 步驟2:換用添加了ITS的stemlineII的基礎培養基進行培養，并在不同時期添 加不同的細胞因子；添加細胞因子BMP4和ActivinA培養4天后，換用細胞因子VEGF和 SCF培養2天；換用造血干/祖細胞維持及擴增相關的細胞因子培養8天，獲得人造血干/ 祖細胞。
[0013] 作為優選，步驟1所述hES克隆為幾十到幾百個hES細胞的克隆團塊。
[0014] 作為優選，BMP4濃度為 10_30ng/ml，ActivinA濃度為 8_12ng/ml。更優選地，BMP4 濃度為 20ng/ml，ActivinA濃度為 10ng/ml。
[0015] 作為優選，VEGF的濃度為30-50ng/ml，SCF濃度為40-60ng/ml。更優選地，VEGF 的濃度為40ng/ml，SCF濃度為50ng/ml。
[0016] 作為優選，所述使用造血干/祖細胞維持及擴增相關的細胞因子為SCF、Flt_3L、 TPO、IL-3、IL-6 與UM171 的組合。
[0017]作為優選，所述細胞因子濃度為SCF40-60ng/ml，FLT-3L40-60ng/ml，ΤΡΟ 8-12ng/ml，IL-3 40-60ng/ml，IL-6 40-60ng/ml，UM171 40-50ng/ml。更優選地，所述細 胞因子濃度為SCF50ng/ml)，FLT-3L50ng/ml，TPO10ng/ml，IL-3 50ng/ml，IL-6 50ng/ml， UM171 45ng/ml〇
[0018] 實驗證實，嘧啶吲哚衍生物UM171能夠提高人多能干細胞（ES，iPS)向造血干/祖 細胞定向分化的效率，通過該方法獲得的造血干/祖細胞具備造血分化多潛能性。提高了 多能干細胞向造血干/祖細胞分化的效率達一倍以上（見附圖2)，獲得的造血干/祖細胞 具備造血分化多潛能性，具有良好的應用前景。
[0019] 術語與定義
[0020] mTeSR:mTeSR是一種無血清的用于hES/iPS維持培養的商品化培養基，用前將 400ml基礎培養基（Catalog#05851)和100ml5X添加物（Catalog#05852)充分混勻，作為 hES/iPS維持培養的完全培養基。
[0021] stemlinell:StemlinII作為hES/iPS造血分化的基礎培養基（Catalog:#S0192 ; Sigma-Aldrich)是一種無血清、無動物源性成分的商品化的造血干細胞培養基，可用于擴 增骨髓、臍帶血和動員的外周血中的造血干細胞，該培養基可維持已分化造血細胞和未分 化造血細胞的平衡，并實現兩種類型細胞最大程度的擴增。
[0022] ITS:ITS(Cat.No:41400-045,Gibco)作為一種常用的培養基添加物，可以促進多 種貼壁細胞的生長，減少細胞對血清的依賴性。用法：作為hES/iPS造血分化基礎培養基的 添加物，100X使用。
【附圖說明】
[0023] 圖1為本發明所述分化過程示意圖。
[0024] 圖2為UM171提高多能干細胞來源的⑶34+⑶45+細胞的百分率。
[0025] 圖3示分化過程中添加UM71分選多能干細胞來源的⑶34+⑶45+細胞形成的造血 各譜系CFU。
【具體實施方式】
[0026] 本發明公開了一種獲得人多能干細胞來源的造血干/祖細胞的方法，本領域技術 人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改 動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法已經 通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和范圍內對本文 所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[0027] 下面結合實施例，