組織工程皮膚種子表皮角質形成細胞高擬體內細胞外基質附著體外篩選培養方法
【技術領域】：
[0001] 本發明屬于生物組織工程皮膚種子角質形成細胞（KC)技術，組織工程領域。涉及 一種體外構建高模擬體內貼附環境分離篩選，皮膚角質形成（KC)細胞的培養、擴增技術。 本發明獲得的KC細胞應用于組織工程皮膚構建技術中的活性種子細胞。 二、
【背景技術】：
[0002] 皮膚是人體最大的器官，參與抵御生物入侵、紫外線輻射以及防止水分丟失、調節 體溫維持個體外貌等方面起著十分重要的生理作用，其是人體免疫系統組成的重要的一部 分，而皮膚細胞是構成這器官的基本單元，皮膚細胞基礎研究領域是揭示皮膚健康、發育、 預防、治療的重要科研途徑。
[0003] 細胞外基質（extracellularmatrix,ECM)廣泛存在于細胞間隙的基本填充成分， 是細胞新陳代謝、生長、繁殖、分化、表達、傳遞、互惠所依賴的及其重要場所。早期研究學者 認為.外基質只是一種組織內、細胞外的單純的支持結構。Hauschka和Konigsberg在1966 年研究發現填充組織間隙的膠原與促進成肌細胞轉化肌管的現象。并在兩年之后，得以證 明學者們才對這種穩定外物質微環境有了新的認識和思考。
[0004] Hay在11年后報道了ECM對胚胎發育過程具有重要的誘導作用。ECM影響細胞行 為的現象得以關注并進行廣泛的研究但是并沒有成型的理論基礎佐證ECM與細胞的密切 關系。直到1982年有學者提出證明并建立ECM與細胞骨架和核基質之間"動態互惠"的模 型。在這個模中，ECM分子與細胞表面受體互相作用，然后把信號通過細胞膜傳導進入細胞 漿中，引起從細胞骨架到細胞核的一系列變化，引起某些特定基因的表達。
[0005] 并證明這些基因的表達產物又可以反過來對ECM發生作用，今天的許多研究證實 了這個模型的合理性，并且證明細胞和ECM相互作用直接參與了細胞的黏附、生長、游走、 分化和程序性死（凋亡）的過程；外基質參與調節細胞因子、生長因子的活性；還能夠直接 激活、啟動細胞內信號傳導機制。由于這種對細胞的調節和對信號的傳導作用。因此，我們 必須充分了解細胞外基質的化學的、物理的、生物學性質和功能及其在組織的形成和修復 中的作用，才能更好地應用這些生物材料構建成為組織接受，乃至模擬組織完善再生的"生 物構架"。我們建立的高擬細胞外基質材料利用的恰是反向理論，指導我們深入開展對ECM 的認識，同時也反作用得到我們可利用的干細胞，這種研究模式促進學科前行及發展。
[0006] 角質形成細胞在正常皮膚組織表皮層，體外培養可形成皮膚層組織，體外培養具 有長期生長潛能并可形成克隆。是愈合修復創面，皮膚更新代謝再生的重要參與者。但由 于目前缺乏理想篩選方法，對KC細胞進行安全篩選報道較少。
[0007] 本發明涉及的角質形成細胞（KC)是表皮細胞主要組成部分，根據其不同的分化 過程及細胞形態通常分為：基底細胞層、棘細胞層、顆粒細胞層和角質層。KC的培養技術已 廣泛應用于皮膚病理學、皮膚美容整復、生理學、藥理學、藥物毒理學、學組織工程學和基因 治療等方面。然而在臨床治療級KC的培養中人們還未取得理想的結果。
[0008] 角質形成細胞（KC)來源于外胚葉，屬于常變細胞，不斷自我更新，在機體發育歷 程中，逐漸分化形成表皮、毛囊上皮主要構成細胞，表皮中90%以上屬于該細胞，余下由黑 素細胞、郎格漢斯、梅克爾細胞構成。
[0009] 最常用于皮膚損傷的修復，如大面積燒傷、植皮手術等，可以應用該細胞與生物支 架材料結合，作為皮膚覆蓋物或替代物的組織工程皮膚。作為組織模炔基本構建常見主要 種子元件。
[0010] 表皮角質形成細胞存在于表皮層，周圍血供良好，營養豐富、所處微環境具有優異 性；在損傷或生長刺激等因素下可自我更新增殖能力強；體外克隆能力突出等優勢細胞特 征。創傷修復的再生重建重要愈合細胞。
[0011] 現有技術傳統篩分方法中，因為皮膚細胞對基底膜有較強的粘附性貼附生長習 性，所以利用細胞外基質該種特性進行培養篩選。目前傳統的皮膚細胞篩選如下闡述：
[0012] 方法一（3T3滋養層法）：人類皮膚細胞體外培養研究已有1個世紀的歷史背景， 建立體外擴增培養體系于1975年由學者Rheinwald和Green所設計3TS-J2小鼠胚胎瘤的 成纖維細胞株3T3滋養層細胞，并用γ射線致死劑量照射，防止干細胞受到異種物種的影 響。滅活3Τ3滋養層細胞作為培養表皮細胞的滋養層能促。進形表皮角質形成細胞篩選的 貼附和生長，并具有未被論證的接觸性抑制成纖維細胞生長的功能。實驗室所選用的、功 能較穩定的個亞系但還不能完全排除對它的顧慮，還需繼續觀察和探索有效的替代方法。 Green研究這種方法的3Τ3雖然它是一個異種的具有問變性質的細胞，有不少實驗室曾試 圖用其他措施予以取代，但至今為止，它的效果在各種方法中仍是最有效的，繼續被廣泛應 用。從第1例臨床應用至令已近30年，尚未發現因它而造成的不良后果。
[0013] 方法二（纖維蛋白原及凝血酶底物法）：GraziellaP學者研究用纖維蛋白原及凝 血酶作為基質分離皮膚細胞；
[0014] 方法三（IV型膠原黏附法）：JonePH等利用上述方法從成人包皮或尸體皮經消 化，利用IV型膠原做底物基質分離表皮角質形成細胞，所選用底物為異種膠原，存在不同 種屬的污染可能性，并且底物昂貴，不適合產業化規模或長期培養，適合試驗性小劑量研 究；
[0015] 方法四（流式細胞儀篩選法）：學者VanRossum麗j與KaurP等從人小塊活檢 組織中得到角朊細胞，利用整合素標記異性標志物利用流式細胞儀分離干細胞，選用方法 復雜且技術要求高，大體應用integrini3 1，細胞黏附分子⑶49,增列細胞核抗原（PCNA)等 多種標記進行特征分離，雖然皮膚細胞得以篩選，但是會留有標記物標記滯留細胞無法有 效去除，存在是否影響干細胞增殖、分化、變異性等。此方法適合標記鑒定測定皮膚細胞，并 不適合臨床應用的皮膚細胞富集方法；
[0016] 方法五（異種成纖維懸浮篩選法）：學者HagarB利用DMEM、低鈣離子鼠成纖維細 胞條件培養液作為培養基，不用滋養層細胞。但有研究報導皮膚細胞與基底膜脫離可誘發 進入分化周期，分化為過渡性擴充細胞，據猜想皮膚細胞與基底膜的高粘附性有可能是維 持皮膚細胞控分化特性的可能條件。所以如果不利用滋養層，有可能長期培養過程中皮膚 細胞分化引起后續研究的不可控發展；
[0017] 方法六（同體成纖維貼附篩選法）：學者金巖等利用參考改進學者HagarB和 Dunnwald鼠成纖維細胞，改成供體預先體外擴增的成纖維細胞為附著底物作為滋養層，培 養同體皮膚細胞，但是專利并沒有明確如何制備滋養層平皿的詳細步驟，鋪皿周期短，成纖 維貼壁力低，篩選反復PBS清洗純化過程會損失部分培養的目標貼附成功的成纖維細胞， 從而降低目標皮膚細胞的得率，皮膚細胞理論上具有同體同原性，另一技術問題在于，兩種 細胞在共有同一培養環境，的考慮培養液的復雜性，兩種細胞可能出現競爭性的生長增殖 抑制等現象，后續分離目標細胞存在技術難度，并不能優于現有的六中常見方法，建議其可 把此方法改成復方加入其它覆皿效果好黏附行為比較大的其它篩選物同用增加目標皮膚 細胞得率，或滅活成纖維鋪皿層細胞或培養過程中添加必要基因素。
[0018] 綜上所述，表皮角質形成細胞對細胞外基質的黏附特性，體外篩選培養的人表皮 角質形成細胞得以在國內外方法特異性快速發展。采用本發明篩選培養可以做到增進功 能、避免潛在有害基因。另在基礎科研、臨床治療、細胞研究方向、皮膚再生損傷修復、高擬 組織工程皮膚的構建方面等均有歷史時期的重要不可取代的指導意義。
[0019] 研究報道了再生組織工程細胞建立系工作始于本世紀（Harrison1907,Carrel1912)，指導引領著生物學，臨床醫學材料等各大銜接領域，稱為重要的基礎科學之一。組織 構建和細胞體外培養是至關重要的課題。從供體捐獻者活體取組織，模擬體內生理環境等 系列特定體外微環境體系，進行孵化培養、使得組織細胞健康生長。
[0020] 組織工程皮膚建立早期應用于修復燒傷和潰瘍以及其它皮膚損傷領域，麻省總醫 院的JohnF.Burke與MIT的YannasI.V.合作，制備首次人工皮膚替代物。但是這種組織 皮膚替代物并不與細胞生物學相關，隸屬于組織工程皮膚支架材料學范疇。隨著細胞生物 學的基礎學科發展，人們開始整合兩大學科，共同協作解決創傷皮膚修復構建，真正的含活 性細胞組織工程皮膚在哈福大學HonwardGreen與MIT的EugenenBellhe合作完成。早 期定制皮膚移植救治取得了生物學醫學介矚目關注。
[0021] 20世紀80年代初期支架材料被FDA許可上市，由膠原網格組成的復合皮膚移植材 料被創造出來，內層為牛膠原和硫酸軟骨素構成，外層為硅膠樹脂，創面移植后內層與創面 接觸被緩慢降解，數周后硅樹脂層移除，清創后覆蓋自體移植皮膚，覆蓋物被臨床所接受。
[0022] MIT的科學家Bellhe把材料學和生物學完美結合創造了組織工程皮膚并建立了 世界上第一家組織工程再生公司（OrganogenesisInc