一種蒼白桿菌及其生物制劑和制備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一種蒼白桿菌及其生物制劑和制備方法與應用。
【背景技術】
[0002]農藥現代農業生產中對病蟲害的的防治是必不可少的，但同時隨著農藥的廣泛大量地使用，也給環境造成人為的污染，農產品中導致農藥殘留的產生，直接威脅著人們的健康。我國已經提出了“農藥零增長計劃”，目的就是減少農藥對環境、人的影響。在減少農殘方面，除了篩選高效低殘留的農藥、科學施用方法、農藥替代等技術外，生物降解也是有效的技術之一。美國科學家從上世紀60年代開始，著手研究污染環境的異生物質包括化學農藥等的微生物降解，旨在通過微生物技術清除環境污染物。國內外有許多報道將微生物作為接種劑直接接種到自然環境中，降解、清除環境中污染物成功的例子。利用微生物對農藥污染物進行降解和轉化有著巨大潛力，這與微生物所具備的幾個方面的特點有關:微生物個體微小，比表面積大，代謝速度快；微生物種類繁多，分布廣，代謝類型多樣；微生物繁殖快、易變異、適應性強；在自然界的生態系統中微生物可產生降解酶將農藥分解為無毒的小分子化合物甚至完全礦化為二氧化碳和水；另外微生物可通過共代謝作用，加快或促進農藥殘留的降解速度。國內外已分離篩選到許多降解或轉化一種或幾種農藥的微生物類群。據不完全統計，已報道的農藥降解細菌至少有28各屬、真菌有14個屬，放線菌有5個屬。細菌主要有假單胞菌屬棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、芽跑桿菌屬(SaciWiAs)、節桿菌屬(AriAraAacter)、黃桿菌屬、黃擔保桿菌屬{Xanthomolza^)。真菌主要有曲霉屬(AspergUJua)、青霉屬{Penlcilliuii)、木霉罵(Trichoderma)和鐮刀菌屬{Fuariuni)。農藥殘留的微生物降解技術相比于物理化學修復技術，具有經濟、高效和無二次污染等優點，是一個有潛力的、充滿希望的農藥污染修復方法。農藥的微生物降解研究受到國內外的關注，在大農業農殘的降解和環境修復中逐步得到應用。甲基托布津是一種高效殺菌劑農藥，化學名為1、2 —二( 3 -甲氧碳基-2-硫脲基)苯，通用名為甲基硫菌靈。由于其化學性質穩定，在土壤中降解半衰期較長，能持久地殘留在使用部位，易致累積效應，由于使用過量常會造成農產品的農藥殘留。然而，目前學術界對甲基托布津殘留降解問題生物降解研究報道較少，市場上也沒有可以大面積使用的甲基托布津降解劑產品。
【發明內容】
[0003]本發明第一目的在于提供一種蒼白桿菌，第二目的在于提供一種以所述蒼白桿菌作為活性成分的生物制劑，第三目的在于提供所述以蒼白桿菌作為活性成分的生物制劑制備方法，第四目的在于提供所述蒼白桿菌作為活性成分的生物制劑的應用。
[0004]本發明第一目的是這樣實現的，所述的蒼白桿菌為中間型蒼白桿菌(Ochrobac trum in termedium) TP 206，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日:2014年11月21日，保藏編號:CGMCC N0.10035 ;所述蒼白桿菌屬于細菌界，變形菌門，α -變形菌綱，根瘤菌目，布魯氏菌，蒼白桿菌屬。
[0005]中間型蒼白桿菌(in termedium) TP 206的獲得與鑒定:
菌株分離篩選方法:
分離培養基:Na2HP04 3g，ΚΗ2Ρ04 1.5g，NH4C1 0.5g，蒸餾水 500ml，瓊脂 7_8g，pH 7.0(用NaOH調節)，在倒平板的時候再加入0.5ml的CaCljP MgSO 4.7Η20，終濃度為0.1 %的甲基托布津。
[0006]量取45ml水放入小三角瓶內，在121°C、20min高壓蒸汽滅菌一稱取5g煙葉樣品放入滅菌后的小三角瓶內，放入30°C，150r/min搖床，30min后取出靜置片刻一用移液槍吸取200ul上層液于已經倒好的的分離培養基平板上，用涂布器涂布均勻一放于37°C恒溫培養箱培養7d—待長出多個單菌落后，在操作臺內挑選長出的單個菌落于已經裝滿1ml LB液體培養基的保存管內一再放于放入30°C，150r/min搖床培養3d —待菌長滿保存管后一加入甘油終濃度達到40%，放于-80 °C冰箱內保藏。
[0007]分離的菌株通過液體培養的方法鑒定其降解甲基托布津的能力。上述分離菌株在LB培養基中培養1天，加入終濃度為200ppm的甲基托布津農藥，繼續振蕩培養3天，取樣通過HPLC檢測方法檢測甲基托布津的殘留量。
[0008]甲基托布津的HPLC檢測方法:取lmL培養液，過0.22 μ m有機相濾膜，待測。色譜柱:Z0RBAX Eclipse XDB- C18 (4.6 X 250mm，5 μ m);柱溫:30.0°C ;檢測波長:275nm，流動相A:CH30H，B:H20，C:CH3CN ;流速:0.7mL/min ;進樣量:10.Ομ?，洗脫采用梯度洗脫。
[0009]菌株分離篩選結果:
通過分離和篩選得到一株能夠在3天培養后高效降解甲基托布津的菌株，降解率達到99.3%,該菌株分離自云南省玉溪市紅塔區煙葉表面，標記為ΤΡ206。該菌株于2014年11月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏登記入冊的編號CGMCCΝ0.10035ο
[0010]菌株鑒定方法
降解菌株的培養特征及生理生化鑒定參照《常見細菌系統鑒定手冊》。和《Bergey’ sManual of Determinative Bacter1logy》進行。菌體總DNA的提取采用高鹽法，并以總DNA為模板，擴增降解菌株的16S rRNA基因序列。PCR擴增產物純化回收，進行TA克隆后進行測序。測序結果使用原核生物鑒定數據庫EzBilCloud (http: //eztaxon~e.ezb1cloud.net/)進行在線比對分析。
[0011]鑒定結果
TP 206菌株系本發明人從大量煙草葉片上篩選出來的，具有顯著降低甲基托布津含量的能力，經生理生化實驗和16S rDNA序列進行鑒定，確定是中間型蒼白桿菌(ifcAraAacir?in termedium ) TP 206 菌株。
[0012]Ochrobac trum in termedium TP 206菌株主要特征為:菌體細胞為短桿狀，排列不整齊，沒有芽孢，革蘭氏染色陰性。在NA培養基表面菌體形成不透明的白色小菌落，表面光滑凸起，菌落干，邊緣不整齊。嚴格好氧，伏-普試驗(V.P.)、甲基紅試驗、吲哚試驗呈陰性，不水解淀粉和明膠，接觸酶、氧化酶反應、硝酸鹽還原、硫化氫試驗呈陽性，能夠利用葡萄糖、麥芽糖等。最適生長溫度為30 °C^PpH為6.5。
[0013]本發明第二目的是這樣實現的，是以所述中間型蒼白桿菌(Ochrobac trumintermedium) TP 206經試管種培養、液體發酵培養后制成的生物制劑。
[0014]本發明的第三目的是這樣實現的，包括試管種培養、液體發酵培養步驟，具體包括:
A、試管種培養:將中間型蒼白桿菌(Ochrobactrum in termedium) TP 206接種到試管斜面培養基上，在溫度28~31°C恒溫培養0.5-1.5天，得試管種；
B、液體發酵培養:將試管種接種到液體培養基中，在溫度28~31V下搖床培養1~3天得到目標物蒼白桿菌為活性成分的生物制劑。
[0015]本發明的第四目的是這樣實現的，所述的蒼白桿菌為活性成分的生物制劑在修復甲基托布津殘留污染土壤中的應用。
[0016]所述的蒼白桿菌為活性成分的生物制劑在降解去除農作物甲基托布津農藥殘留中的應用。
[0017]本發明人使用中間型蒼白桿菌(ifcAraAaciri/a? in termedium) TP 206，經發酵生產過程，制備了甲基托布津農藥殘留降解菌劑，該菌劑對甲基托布津殘留的降解率達到80以上，可廣泛用于土壤甲基托布津污染或農作物甲基托布津的農藥殘留。
[0018]本發明使用所述菌株TP206發酵生產的甲基托布津農藥降解菌劑可廣泛用于土壤中甲基托布津殘留污染的修復，還可以在農業生產中直接噴灑于土壤或作物表面，可以有效降解去除甲基托布津農藥殘留，使用方便，成本低廉。
【具體實施方式】
[0019]下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但不以任何方式對本發明加以限制，基于本發明教導所作的任何變換或改進，均落入本發明的保護范圍。
[0020]本發明所述的蒼白桿菌為中間型蒼白桿菌(OcAraAacir.in termedium) TP 206，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日:2014年11月21日，保藏編號:CGMCC N0.10035 ;所述蒼白桿菌屬于細菌界，變形菌門，α -變形菌綱，根瘤菌目，布魯氏菌，蒼白桿菌屬。
[0021]本發明所述的蒼白桿菌為活性成分的生物制劑，是以所述中間型蒼白桿菌(Ochrobac trum in termedium) TP 206經試管種培養、液體發酵培養后制成的生物制劑。
[0022]所述的蒼白桿菌為活性成分的生物制劑中菌濃度為:每ml活菌數多108o
[0023]本發明所述的蒼白桿菌為活性成分的生物制劑的制備方法，包括試管種培養、液體發酵培養步驟，具體包括:
A、試管種培養:將中間型蒼白桿菌(Ochrobactrum in termedium) TP 206接種到試管斜面培養基上，在溫度28~31°C恒溫培養0.5-1.5天，得試管種；
B、液體發酵培養:將試管種接種到液體培養基中，在溫度28~31V下搖床培養1~3天得到目標物蒼白桿菌為活性成分的生物制劑。
[0024]A步驟中所述的試管斜面培養基的成分為:葡萄糖l~3g，牛肉浸膏0.5-1.5 g，氯化鈉 0.4-0.7 g，MgS04.7H20 0.1-0.3 g，瓊脂 1.5-2 g，其余為水，pH 值為 5.5-8.0。
[0025]B步驟中所述的液體培養基的成分為:葡萄糖1~2 g，牛肉膏0.1~0.3 g，豆餅粉
0.8-1.2g，氯化鈉 0.3-0.5 g，MgS04.7H20 0.2-0.4 g，其余為水，pH 值為 5.5-8.0。
[0026]B步驟中所述搖床的轉速為180~200rpm。
[0027]本發明所述的蒼白桿菌為活性成分的生物制劑的應用為所述的蒼白桿菌為活性成分的生物制劑在修復甲基托布津殘留污染土壤中的應用。
[0028]本發明所述的蒼白桿菌為活性成分的生物制劑的應用為所述的蒼白桿菌為活性成分的生物制劑在降解去除農作物甲基托布